醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其機(jī)制※

鄒 勇 張鳳蘭 付毅敏

（1山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，煙臺(tái)264000；2山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院眼科，煙臺(tái)264000；3山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院保健科，煙臺(tái)264000）

醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其機(jī)制※

鄒 勇1張鳳蘭2付毅敏3

（1山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，煙臺(tái)264000；2山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院眼科，煙臺(tái)264000；3山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院保健科，煙臺(tái)264000）

目的 觀察醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并研究其可能的機(jī)制。方法通過反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈同時(shí)腹腔注射硝普鈉的方法制備血管性癡呆大鼠模型。然后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、醒智散小、中、大劑量組，每組20只。各組給予相應(yīng)藥物或溶媒，1次／d，連續(xù)7d。在第3d各組隨機(jī)抽取10只大鼠進(jìn)行腦內(nèi)氧化損傷相關(guān)因子SOD、MDA以及凋亡抑制因子Bcl-2檢測；第8d開始，給藥同時(shí)用Morris水迷宮檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；第14d學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)束后，檢測腦組織海馬病理以及乙酰膽堿酯酶活性。結(jié)果第3d：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦內(nèi)SOD、Bcl-2表達(dá)顯著降低，MDA顯著增加；與模型組比較，醒智散中、大劑量能提高腦內(nèi)抗氧化因子SOD、抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)，降低氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。第14d：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長，海馬區(qū)存活海馬神經(jīng)元顯著減少；與模型組比較，尼莫地平和醒智散中、大劑量能顯著縮短血管性癡呆大鼠的逃避潛伏期，但沒有顯著影響乙酰膽堿酯酶的活性；尼莫地平和醒智散中、大劑量能顯著降低海馬神經(jīng)元損傷，增加存活神經(jīng)元數(shù)目。結(jié)論醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有改善作用，其機(jī)制可能與抗氧化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

血管性癡呆；醒智散；學(xué)習(xí)記憶；SOD；MDA；Bcl-2

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是各種腦血管疾病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的臨床綜合征，是一種慢性進(jìn)行性疾病。在祖國醫(yī)學(xué)屬于“呆病”范疇，多發(fā)生于中風(fēng)病之后，其病位在腦，病因病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)，與腎、心、肝、脾、肺關(guān)系密切，痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)，腦竅失養(yǎng)致呆為本病的發(fā)病基礎(chǔ)。本文作者在中醫(yī)學(xué)理論和臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，在《證治準(zhǔn)繩》“不忘散”原方基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床治療血管性癡呆的經(jīng)驗(yàn)，以“不忘散”方去茯神，加葛根、丹參、天竺黃，創(chuàng)制了“醒智散”顆粒劑，臨床用于血管性癡呆病人的治療，能顯著改善病人的學(xué)習(xí)記憶能力，但作用機(jī)制不清。本研究通過在血管性癡呆大鼠模型上應(yīng)用醒智散，擬明確醒智散改善癡呆患者學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠，體重220～250g，山東綠葉制藥有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2009 0009。

1.2 試劑、儀器醒智散：顆粒狀。

尼莫地平片：購自天津市中央藥業(yè)有限公司。

碘化乙酰膽堿，購自Sigma公司。

SOD檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20120109。

MDA檢測試劑盒：購自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20120308。

大鼠Bcl-2抗體：購自Abcam公司。

羊抗兔二抗，組織裂解液，ECL發(fā)光液，SDS-聚丙烯酰胺凝膠配制盒，顯影、定影液，均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

Morris水迷宮：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)。

酶標(biāo)儀：Biotek公司。

切片機(jī)：Leica公司。

2 方法

2.1 血管性癡呆大鼠模型制備參考文獻(xiàn)［1］描述方法制備血管性癡呆大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，4h禁水，用10%水合氯醛（350mg／kg）麻醉。麻醉成功后，將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，頸前部去毛，常規(guī)消毒，頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），模型組及藥物治療組在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉（2.5mg／kg），隨即用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA10min，再通10min，共間歇阻斷、再通雙側(cè)CCA血流3次。然后縫合傷口。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)CCA，但不夾閉CCA及注射硝普鈉。造模過程中保持大鼠肛溫在37℃，術(shù)后連續(xù)3d給予青霉素預(yù)防感染。

2.2 動(dòng)物分組及給藥將120只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平（10 mg／kg）組、醒智散小劑量（3g／kg）、醒智散中劑量（6g／kg）、醒智散大劑量（9g／kg）組，每組20只。按上述方法制作大鼠血管性癡呆模型，各組動(dòng)物手術(shù)完成0.5 h后分別給予相應(yīng)藥物。每天1次，連續(xù)14 d。在第3 d每組隨機(jī)抽取10只大鼠，進(jìn)行腦內(nèi)氧化損傷相關(guān)因子SOD、MDA以及凋亡抑制因子Bcl-2檢測。第8～14d進(jìn)行空間學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練和測試，測試結(jié)束后進(jìn)行腦組織海馬病理檢測和AChE檢測。

2.3 空間學(xué)習(xí)記憶能力測試采用morris水迷宮實(shí)驗(yàn)法。正式實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d，每天訓(xùn)練1次，每次120s，從平臺(tái)所在象限的相鄰象限中選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期（escape latency）。如果動(dòng)物在120s內(nèi)未找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)停留20s，逃避潛伏期記為120s。

2.4 腦組織樣品處理及H-E染色水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，將其仰臥于平臺(tái)上，伸展固定四肢，剪開胸腹充分暴露心臟和肝臟。剪開左側(cè)心尖部，迅速插導(dǎo)管于左心室至升主動(dòng)脈并固定，同時(shí)剪開右心耳?？焖俟嘧⑸睇}水至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，換用4%多聚甲醛固定液灌注約100ml至大鼠肝臟變硬，肢體僵直，即固定完成。然后斷頭，完整取出鼠腦后投入含20%蔗糖的多聚甲醛溶液中后固定24h以上（4℃）。待腦組織下沉后，石蠟包埋，5μm厚度切片，H-E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬病理變化。

2.5 膽堿酯酶活性檢測水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠麻醉處死，在冰上迅速取出全腦，分離海馬組織稱重，按質(zhì)量比1∶9的比例加入生理鹽水，勻漿，3000r／min離心10min，取上清（待測樣品）。在96孔板上，每孔加入0.1 M PBS 30μl，待測樣品30μl，最后加入10 mM碘化乙酰膽堿30μl，振蕩混勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，加入1 M HCl 10μl終止反應(yīng)。放置20min后加0.03%DTNB（用0.3M PBS配制）200μl，總體積為300μl，震蕩混勻，405nm測定OD值。AChE活性用U／g蛋白表示。

2.6 SOD、MDA檢測每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉處死，在冰上迅速取出全腦，分離海馬組織稱重，按質(zhì)量比1∶9的比例加入生理鹽水，勻漿，3000 r／min離心10 min，取上清（待測樣品）。按照SOD、MDA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.7 Bcl-2檢測每組隨機(jī)取5只大鼠，麻醉處死，在冰上迅速取出全腦，分離海馬組織稱重。加入裂解液充分裂解，14000rpm 4℃離心5min。取上清液用BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，煮沸5min，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?2%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每道上樣25μg，160V電泳。然后在106 V條件下轉(zhuǎn)膜70min。TBST洗膜1次，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h。加入Bcl-2（1∶1000）一抗孵育過夜。TBST洗膜4次，每次5min。加入羊抗兔二抗（1∶2000）室溫孵育2h。TBST洗膜4次，每次5min。在膜上滴加400μl ECL發(fā)光液，放入暗盒，壓上膠片，曝光5 min。顯影、定影，對(duì)圖像分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用（±SD）表示，組間比較先檢驗(yàn)資料的正態(tài)性和方差齊性，方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)，符合條件者采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響各組大鼠的逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)增加均呈下降趨勢。第3、4d，模型組大鼠的逃避潛伏期與正常組相比明顯延長（P＜0.05）；尼莫地平與醒智散大劑量組與模型組相比逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05）；而醒智散小、中劑量組與模型組比較未見顯著差異。第5 d，醒智散中、大劑量組、尼莫地平組與模型組相比逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響±S，n＝10）

表1 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響±S，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

級(jí)別day 1 day 2 day 3 day4 day 5假手術(shù)83．7±18．8 69．7±16．2 48．8±16．0 48．4±16．3 42．4±12．3模型94．4±14．3 88．6±24．3 88±25．1▲▲79．3±16．5▲▲76．8±17．8▲▲尼莫地平81．5±19．2 67．6±25．9 62±18．8*57．2±19．5*47．9±15．4**醒智散（小）88±22．1 85．3±16．3 74±15．7 72±19．0 60．9±17．5醒智散（中）84．7±28．0 71．9±15．1 68．3±16．0 67．1±17．4 49．8±12．0**醒智散（大）79．3±20．0 73．6±18．9 56．8±18．3*53±21．4*48．30±16．5**

圖1 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（±SD，n＝10）

3.2 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬AChE活性的影響

與模型組比較，尼莫地平與醒智散各劑量組對(duì)AChE活性未見顯著影響。見表2、圖2。

表2 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬AChE活性的影響±S，n＝7）

表2 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬AChE活性的影響±S，n＝7）

注：與模型組比較，*P＜0.01

組別劑量AChE活性（U／g蛋白）假手術(shù)—4．1±1．3模型—3．4±0．5尼莫地平10mg／kg 2．9±0．6醒智散（?。?g／kg 3．3±0．4醒智散（中）6g／kg 3．1±0．6醒智散（大）9g／kg 3．3±1．2

圖2 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬AChE活性的影響

3.3 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元受損嚴(yán)重，存活神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。與模型組比較，尼莫地平和醒智散中、大劑量能顯著降低海馬神經(jīng)元損傷，增加存活神經(jīng)元數(shù)目。見圖3。

圖3 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響（放大倍數(shù)10×40）

3.4 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬SOD、MDA產(chǎn)生的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)MDA產(chǎn)生明顯增多，SOD明顯降低。與模型組比較，尼莫地平和醒智散大劑量能顯著降低海馬區(qū)MDA含量，增加SOD含量。

表3 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬SOD、MDA產(chǎn)生的影響±SD，n＝5）

表3 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬SOD、MDA產(chǎn)生的影響±SD，n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組別劑量SOD（U／mg）MDA（nmol／mg）假手術(shù)—68．6±6．1 2．6±0．3模型—50．4±7．1▲▲3．4±0．3▲▲尼莫地平10 mg／kg 62．4±6．1*2．7±0．5*醒智散（?。?g／kg 53±10．2 3．1±0．3醒智散（中）6g／kg 62．2±7．0*3．1±0．4醒智散（大）9g／kg 66．4±7．7**2．8±0．4*

3.5 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)凋亡抑制分子Bcl-2表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)明顯減少；與模型組比較，醒智散中、大劑量能顯著提高海馬區(qū)Bcl-2表達(dá)。見圖4。

圖4 醒智散對(duì)血管性癡呆大鼠海馬區(qū)凋亡抑制分子Bcl-2產(chǎn)生的影響

4 討論

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是由腦血管因素引起的腦組織受損導(dǎo)致的一種認(rèn)知功能障礙綜合征。血管性癡呆在我國所占比例較高（10%～50%），僅次于阿爾茨海默病，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。目前，尚缺乏理想的血管性癡呆治療藥物。

本文作者在中醫(yī)學(xué)理論和臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，在《證治準(zhǔn)繩》“不忘散”原方基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床治療血管性癡呆的經(jīng)驗(yàn)，以“不忘散”方去茯神，加葛根、丹參、天竺黃，創(chuàng)制了“醒智散”顆粒劑，臨床用于血管性癡呆病人的治療，能顯著改善病人的學(xué)習(xí)記憶能力，但作用機(jī)制不清。因此本實(shí)驗(yàn)制備了大鼠血管性癡呆模型，擬進(jìn)一步明確醒智散治療血管性癡呆的可能機(jī)制。

目前血管性癡呆動(dòng)物模型有四血管結(jié)扎法、兩血管結(jié)扎結(jié)合硝普鈉法以及大腦中動(dòng)脈栓塞法等。本實(shí)驗(yàn)采用反復(fù)夾閉、再通雙側(cè)頸總動(dòng)脈加硝普鈉法制備大鼠血管性癡呆模型，很好地模擬了人類血管性癡呆的發(fā)病過程，最終導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)元損傷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙［2］。醒智散能顯著減輕血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元損傷，提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。進(jìn)一步在動(dòng)物模型上驗(yàn)證了醒智散治療血管性癡呆的良好療效。

體內(nèi)氧自由基過量，引起組織氧化損傷，是導(dǎo)致血管性癡呆的重要因素之一。清除自由基可防止組織過氧化損傷，延緩癡呆病情。MDA是脂質(zhì)過氧化生成物，其產(chǎn)生的多少可反映機(jī)體受自由基損傷的程度。SOD具有清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化的作用，提高體內(nèi)SOD活性，可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的傷害。本實(shí)驗(yàn)通過腦缺血再灌注制備血管性癡呆模型，可觸發(fā)腦組織中自由基的過量產(chǎn)生。而給予中藥醒智散，可顯著提高腦組織SOD活性，大大降低MDA的含量。結(jié)果表明醒智散具有明顯的抗氧化能力［3-4］。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程。而在參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡的分子中，Bcl-2發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。據(jù)報(bào)道在大腦中動(dòng)脈栓塞所致的局灶性腦缺血模型，人為增加腦內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，提示Bcl-2在缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷中起到了保護(hù)作用［5］。本實(shí)驗(yàn)顯示，醒智散能顯著提高Bcl-2在海馬神經(jīng)元的表達(dá)，提示其能通過抗凋亡作用保護(hù)受損神經(jīng)元。

［1］劉斌，毛文靜，李愛春，等．參芎化瘀膠囊對(duì)血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)p38絲裂原活化蛋白激酶表達(dá)的影響［J］．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（8）：161-165．

［2］王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等．大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進(jìn)［J］．中國病理生理雜志，2000，16（10）：914-6．

［3］王金萍，王占慶，曾明，等．健腦口服液對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及腦組織SOD、MDA和AchE活性的影響［J］．中國老年學(xué)雜志，2010，30（17）：2479-80．

［4］Li RP，Wang ZZ，Sun MX，et al．Polydatin protects learning and memoryimpairments in a rat model of vascular dementia［J］．Phytomedicine，2012，19（8-9）：677-81．

［5］Sulejczak D，Czarkowska-Bauch J，Macias M，et al．Bcl-2 and Bax proteins are increased in neocortical but not in thalamic apoptosis following devascularizing lesion of the cerebral cortex in the rat：an immunohistochemical study［J］．Brain Res，2004，1006（2）：133-49．

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.20.105

1672-2779（2013）-20-0154-03

楊 杰

2013-08-26）

山東省煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目［No：2011223］