植物體內(nèi)自由基清除劑抗壞血酸研究進展

閆慧芳，夏方山，王明亞，毛培勝

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 草業(yè)科學北京市重點實驗室 中國農(nóng)業(yè)大學草地研究所，北京 100193)

抗壞血酸(Ascorbic Acid,AsA)又叫維生素C(Vitamin C,Vc)，是植物體內(nèi)的重要抗氧化劑之一，它具有水溶性，能夠清除植物各項代謝過程中產(chǎn)生的自由基，減少膜脂過氧化作用對細胞造成的傷害[1]。AsA有L-型和D-型兩種異構(gòu)體[2]，其中L-型異構(gòu)體即維生素C，能夠治療壞血酸病，D-型異構(gòu)體無治療壞血酸病的作用，但兩者均具有抗氧化功能。AsA廣泛存在于高等動物、蘚類和藻類等光合真核生物的細胞質(zhì)、液泡、葉綠體、線粒體和細胞壁等結(jié)構(gòu)內(nèi)，其在葉綠體中的濃度可達到20 mmol·L-1。

AsA作為植物細胞內(nèi)的一種己糖內(nèi)酯類化合物，在植物細胞分裂與生長、細胞壁組成和光合作用等正常生長發(fā)育代謝活動以及抵御逆境脅迫的抗氧化保護等方面具有重要的功能，特別是其作為抗氧化劑對逆境脅迫下植物細胞老化的調(diào)節(jié)功能，成為近些年來研究的重點。研究表明，植物體中AsA的含量與抗逆性呈正相關(guān)，細胞中AsA含量增加可以增強植物耐鹽耐旱耐熱等能力[3]。 因此，對AsA在植物抵抗活性氧自由基傷害過程中的生理作用及其與植物抗逆性的關(guān)系進行研究具有重要的意義。

1 抗壞血酸的生物合成途徑

70多年前，AsA在動物細胞中的合成途徑就已經(jīng)被研究清楚，但其在植物體中的合成途徑卻一直倍受爭議，曾經(jīng)有很多學者提出了AsA的碳鏈倒位途徑(Inversion Pathway)、鄰酮醛糖途徑(Osone Pathway)、L-半乳糖途徑(L-galactose Pathway或Smirnoff-Wheeler Pathway)和糖醛酸途徑(Uronic acids Pathway)等學說[4]。目前能夠被廣泛認可的植物體內(nèi)AsA的合成途徑有4種，分別為糖醛酸途徑、L-半乳糖途徑、肌醇途徑和L-古洛糖途徑。 Davey等[5]用擬南芥(Arabidopsisthaliana)懸浮細胞做研究發(fā)現(xiàn)，半乳糖醛酸是植物體內(nèi)AsA合成的底物，并由此認為植物中AsA的合成途徑是糖醛酸途徑。L-半乳糖途徑也被稱為Smirnoff-Wheeler途徑，是由Wheeler等[6]在前人研究工作的基礎(chǔ)上總結(jié)后提出的，他們認為該途徑在AsA的合成中起著重要作用，這一合成途徑在研究含有來自草莓(Fragariaananassa)果實的D-半乳糖醛酸還原酶基因的擬南芥試驗中得到了證實[7]。肌醇途徑是指肌醇在肌醇加氧酶的作用下生成葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸參與糖醛酸途徑并促進植物AsA的合成[8]。在用擬南芥研究AsA代謝模式中發(fā)現(xiàn)，植物細胞中存在古洛糖酸，研究者認為植物中存在一個表異構(gòu)酶，可以催化L-古洛糖醛酸-1,4-內(nèi)酯與L-半乳糖醛酸-1,4-內(nèi)酯的相互轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)[9]，煙草(Nicotianatabacum)和生菜(Lactvcasativa)中的L-古洛糖醛酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶基因可以促進AsA含量的提高。由此可見，AsA通過多種合成途徑共同維持植物自身的正常生長發(fā)育，并保證和增強植物對生態(tài)環(huán)境的適應性。

2 AsA的生理功能

AsA作為植物體內(nèi)一種重要的自由基清除劑，在植物生長發(fā)育及代謝方面起著重要作用。前人眾多研究證實了AsA可以參與植物細胞的分裂與伸長、作為輔酶參與細胞壁的形成、對光合系統(tǒng)有保護作用、作為電子傳遞和信號轉(zhuǎn)導的載體，維持細胞氧化還原狀態(tài)平衡等。特別是近些年來，有關(guān)其與植物抗逆境脅迫關(guān)系的研究受到很多學者的青睞，成為該領(lǐng)域研究的重點關(guān)注對象。

2.1參與細胞分裂與伸長 細胞中AsA含量的高低與該細胞的生長狀態(tài)有關(guān)[10]，一般認為，分裂活動旺盛的細胞中AsA的含量要高于非分裂狀態(tài)的細胞?？箟难嵫趸?Ascorbate Oxidase,AOX)主要存在于細胞壁中，其活性隨著細胞分裂活躍程度的降低而升高。研究表明，AOX和編碼該酶的mRNA的活性在細胞分裂時期較低，在細胞非分裂時期則較高[11]?？梢姡毎蠥sA與AOX的含量呈負相關(guān)，這一結(jié)果是因為AOX具有氧化性，可以氧化AsA，致使細胞AsA含量降低。

AsA是細胞分裂所必需的，它參與具有調(diào)節(jié)細胞周期進程功能的富羥脯氨酸糖蛋白(Hydroxyproline-rich Glycoproteins,HRGPs)的脯氨酸羥化作用。眾多研究者發(fā)現(xiàn)，外源AsA可以促使處于分裂期的感受態(tài)細胞由G1期進入S期，使不活動中心細胞數(shù)量減少，并且當細胞中AsA含量不足時，蛋白質(zhì)的脯氨酸羥化作用會受到抑制，進而使細胞分裂進程受阻[12]。黃文敏等[13]對外源AsA促進煙草細胞分裂的研究表明，2 mmol·L-1的AsA可以使煙草細胞分裂生長速率加快、可溶性蛋白含量增加、細胞膜透性降低、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低、AsA和谷胱甘肽(Glutathiose,GSH)含量維持在較高水平，這說明AsA在促進細胞分裂和生長、減輕逆境脅迫下細胞膜所受的傷害和膜脂過氧化作用、延緩細胞衰老等方面起著重要的作用。

相關(guān)研究認為，AsA和AOX在細胞生長伸長過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[14]。AsA調(diào)節(jié)細胞伸長是通過酸生長理論[15]或ABA等植物激素介導[16]來刺激細胞伸長的。細胞生長過程中細胞壁在AOX的作用下產(chǎn)生MDA，MDA被結(jié)合在質(zhì)膜上的細胞色素還原產(chǎn)生AsA，還原后的AsA再通過電子的跨膜運輸被轉(zhuǎn)運到質(zhì)外空間。同時，AsA促進細胞伸長的作用還通過控制細胞壁蛋白和多糖的交聯(lián)、木質(zhì)素單體聚合作用調(diào)節(jié)胞壁木質(zhì)化和Ca2+水平來完成。Kato和Esaka[11]報道，細胞伸長過程中，AsA、AOX活性及相關(guān)的mRNA含量均升高。

2.2作為輔酶參與細胞壁的形成 作為羥脯氨酸的輔酶，AsA參與了細胞壁結(jié)構(gòu)的形成。細胞壁結(jié)構(gòu)的骨架物質(zhì)HRGPs，是細胞壁的重要組成成分，當細胞遭到病蟲害或其它損傷時，細胞將會通過脯氨酸羥基化作用形成HRGPs[17]。AsA作為肽基-脯氨酰羥基化酶和肽基-賴氨酰羥基化酶的輔酶在脯氨酸和羥賴氨酸的合成中起到催化作用，進而參與HRGPs的合成。AsA還可以直接參與誘導HRGPs的合成[18]。另外，AsA是一些植物激素如赤霉素、花青素、乙烯等物質(zhì)合成代謝中的輔酶[19]。因此，AsA對植物生長發(fā)育具有重要的生理作用。

AsA參與細胞中ROS的清除既可以是直接的，也可以是間接的。AsA除了作為APx的輔酶清除光系統(tǒng)Ⅰ(PSI)氧氣還原形成的H2O2外[21]，還是光保護過程葉黃素循環(huán)(Xanthophyll Cycle)中紫黃質(zhì)去環(huán)化酶(VDE)的輔酶，在環(huán)氧化過程中起到非常重要的作用[22]。其促使VDE作用下紫黃素脫環(huán)氧化生成環(huán)氧玉米黃素，環(huán)氧玉米黃素進一步脫環(huán)氧化生成玉米黃素，參與光系統(tǒng)Ⅱ的非光化學淬滅，將多余的光能轉(zhuǎn)化為其它形式的能量散失[23]。如沙棘(Hippophaerhamnoides)等旱生植物果實中AsA含量極高，這是植物為適應干旱環(huán)境而進化的結(jié)果。外源AsA可以啟動干旱脅迫下歐李(Cerasushumilis)葉片細胞的葉黃素循環(huán)，產(chǎn)生大量內(nèi)源AsA，增加葉黃素循環(huán)中玉米黃素的含量，提高VDE的表達水平，進而提高植物的抗脅迫能力[24]。另外，液泡膜和質(zhì)膜上含有AsA所依賴的細胞色素b561，在植物細胞光合作用過程電子傳遞中占有重要作用。因此，AsA在光合作用中起清除ROS和消除多余電子的作用。

但是，細胞中含有過量的AsA會加劇其自身氧化，其含量維持在一個安全濃度是保護細胞不受損傷的關(guān)鍵。研究表明，黃瓜(Cucumissativus)、甜瓜(C.melo)和蘿卜(Raphanussativus)葉綠體中過量的維生素C加劇了電子的傳遞速率，使膜脂過氧化程度加深[25-26]。Packer等[27]認為，AsA能夠加速氧化可能是因為細胞中存在著與AsA偶聯(lián)的不協(xié)調(diào)氧化還原系統(tǒng)，這一偶聯(lián)作用阻止了AsA對超氧陰離子等自由基的清除，或者是較高濃度的外源AsA激活了細胞內(nèi)的脂氧化酶，促使膜脂中不飽和脂肪酸加速氧化。

2.4作為電子傳遞和信號轉(zhuǎn)導的載體，維持細胞氧化還原狀態(tài)平衡 逆境條件下，植物體內(nèi)代謝過程中的電子傳遞鏈很容易遭到破壞，尤其是光合作用中的電子傳遞，而AsA和GSH在葉綠體water-water循環(huán)中能以協(xié)同作用清除光呼吸反應產(chǎn)生的ROS[28]。AsA被認為是調(diào)節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)中的重要信號物質(zhì)，在光合系統(tǒng)、線粒體的電子傳遞及減輕逆境對植物傷害等過程中發(fā)揮重要功能[29]。

氧化還原過程中，AsA是光系統(tǒng)Ⅱ的電子供體，其氧化產(chǎn)物MDA可以作為光系統(tǒng)Ⅰ的電子受體參與電子的跨膜運輸，清除自由基，從而達到恢復植物體內(nèi)氧化還原勢穩(wěn)態(tài)平衡的效果[30]。研究表明，細胞中AsA的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA)及與其合成代謝相關(guān)的酶活性變化在植物抵抗逆境環(huán)境中發(fā)揮著不可替代的作用[31]。鹽脅迫下，植物細胞中AsA含量降低，AsA/DHA比率降低，相關(guān)酶APx和MDHAR活性降低，從而導致植物抵抗逆境脅迫的能力下降[32-33]。而適宜濃度的外源AsA處理植物可以降低細胞內(nèi)MDA和H2O2含量，提高APx、MDHAR、DHAR和GR等酶活性，增加AsA/DHA比率[34]。AsA氧化后的產(chǎn)物DHA能夠形成胞壁草酸，草酸與細胞間隙中起信號轉(zhuǎn)導調(diào)控作用的Ca2+結(jié)合形成結(jié)晶[35]，通過控制細胞中Ca2+的含量來間接調(diào)控多種代謝和基因的表達[36]。同時，DHA信號傳導途徑在低溫誘導煙草早花過程中有一定作用[37]。

研究還發(fā)現(xiàn)，植物細胞質(zhì)外體中AsA的含量及氧化還原狀態(tài)對植物抵抗逆境脅迫也起著不可忽視的作用[38]。質(zhì)外體中的AsA作為一種氧化還原緩沖劑，是抵抗外界環(huán)境氧化脅迫的第一道防線，主要用于抵抗大氣污染物等對植物細胞造成的傷害，從而保護細胞質(zhì)膜的完整性。因此，細胞中含有較高濃度的AsA可以增強植物對逆境環(huán)境的抗性能力。

3 AsA參與植物逆境脅迫

植物處于正常生長條件下時，各項生理代謝過程產(chǎn)生的自由基維持在安全水平，不會對植物細胞造成任何傷害，但是當其遭受強光刺激、干旱、鹽堿、極端溫度、營養(yǎng)缺乏等其它脅迫環(huán)境條件時，細胞內(nèi)多種電子傳遞鏈就會產(chǎn)生活性氧，如過氧化氫、超氧陰離子和羥自由基(Hydroxyl Radical，OH·)等。過量的ROS超過植物固有的抗氧化能力，便會對細胞造成氧化脅迫。植物體內(nèi)ROS代謝水平取決于其產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，當外界條件發(fā)生變化時，這種平衡可能會被打破。生物體內(nèi)ROS的積累和膜脂過氧化是需氧生物遭受逆境傷害的重要特征。

植物為了適應不斷變化的環(huán)境，體內(nèi)進化出了復雜的抗氧化系統(tǒng)，如隨著干旱脅迫程度的加深，蘋果(Maluspumila)組織的AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)防御能力達到最大后開始下降[39-40]。AsA除了在維持植物正常生長和代謝方面起著重要作用外，還是該抗氧化系統(tǒng)中的一種重要抗氧化劑，在植物抵抗逆境脅迫、保護細胞免受逆境傷害方面也發(fā)揮著重要的生物學功能。

3.1AsA參與溫度脅迫 高溫條件下，植物細胞的膜結(jié)構(gòu)是ROS攻擊的主要目標，多數(shù)研究認為，自由基是通過膜脂過氧化作用對細胞膜造成傷害的，表現(xiàn)為膜通透性增大，電解質(zhì)滲漏增多，抗氧化物質(zhì)及相關(guān)酶活性變化等[41-45]。另外，高溫還破壞了植物光合作用中的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)和類囊體膜，阻斷了電子傳遞的通路，抑制光合作用進行。

植物體內(nèi)AsA主要通過葉黃素循環(huán)和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)(Ascorbate-G1utathlione，AsA-GSH Cycle)兩大系統(tǒng)來清除逆境脅迫下植物細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，使細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)得以維持，保護細胞免遭侵害。研究表明[46]，高溫脅迫下，蘋果細胞內(nèi)AsA含量下降、GSH含量上升，而施用適宜濃度外源AsA后，細胞內(nèi)AsA含量明顯增加，GSH含量下降，抗氧化物酶活性下降受到抑制，丙二醛含量和膜透性增加得到緩解，這說明AsA主要通過AsA-GSH循環(huán)對細胞內(nèi)AsA和GSH這兩種物質(zhì)產(chǎn)生不同影響，起到提高蘋果組織熱穩(wěn)定性的作用。

外源施用AsA或AsA的合成前體L-半乳糖內(nèi)酯后，水稻(Oryzasativa)根部和莖部細胞內(nèi)的AsA含量顯著提高，植株的抗寒能力得到增強[47]。最新研究從番茄(Lycopersiconesculentum)細胞中分離到的類囊體膜抗壞血酸過氧化物酶基因LetAPX如果在植株中表達沉默，則植株內(nèi)APx的活性降低，H2O2的含量升高，因此，LetAPX基因的成功表達對葉綠體等細胞超微結(jié)構(gòu)具有保護作用，可使其免受低溫的破壞[48]。

3.2AsA參與鹽脅迫 鹽脅迫是植物在自然界中所受的典型脅迫之一，對植物細胞造成傷害主要因為離子平衡被破壞。鹽脅迫對植物造成的傷害表現(xiàn)在光合作用過程中葉綠素和類胡蘿卜素受損，氣孔關(guān)閉，光合速率下降；細胞呼吸作用增強，能量消耗增多；細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，分解加速，導致蛋白質(zhì)含量減少；代謝過程中有毒有害物質(zhì)積累對細胞造成毒害作用等，嚴重的可使細胞代謝紊亂，甚至導致組織和細胞的死亡[49-50]。

AsA可以緩解鹽脅迫對植物造成的損傷，如何文亮等[51]對鹽脅迫下擬南芥野生型(wt)和抗壞血酸突變體(vtc-1)的研究發(fā)現(xiàn)，vtc-1中AsA總含量和GSH/GSSG比值下降，SOD、CAT活性降低，而wt中SOD、CAT、APX活性升高。外源AsA能夠緩解鹽脅迫對小麥(Triticumaestivum)幼苗生長的抑制作用，使幼苗根長、芽長得到提高，幼苗葉片可溶性蛋白含量升高，細胞膜透性及膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著降低[52]。它還可以增強鹽脅迫下大麥(Hordeumvulgare)細胞液泡膜上H+-ATPase和H+-PPase的活性，從而降低膜脂過氧化作用對細胞造成的傷害[53]。這一結(jié)果與在水稻[54]和番茄[55]等中的研究結(jié)果相似。

同時，AsA參與了種子萌發(fā)過程中貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，研究表明[56]，外源AsA彌補了高鹽條件下小麥種子中由于自身合成維生素能力受抑制而導致的含量不足，增強了小麥的抗鹽能力。AsA參與了植物細胞內(nèi)ROS代謝的清除，增強了逆境脅迫下植物的抗逆性。

3.3AsA參與微生物脅迫 植物在生長過程中會受到許多微生物的干擾與影響，某些微生物可對植物造成致命脅迫。Barth等[57]用兩種不同的致病真菌侵染擬南芥抗AsA缺失突變體vtc1和vtc2來研究AsA缺失對生物脅迫的作用，結(jié)果表明，vtc1被感染后，細菌和菌絲的生長明顯受到抑制；而vtc2被感染后，真菌的生長也受到抑制，這表明AsA缺失對病原有一定的抗性。

3.4AsA參與的其它過程 AsA作為抗氧化劑，對逆境條件下植物所受的自由基侵害有一定的緩解作用。外源AsA處理逆境脅迫下的植株幼苗，幼苗細胞內(nèi)SOD和POD的活性升高，GSH和AsA的含量增加，MDA含量和膜透性增加的幅度減小，外源AsA能夠緩解植株生長所受的抑制作用[58-59]。分離的沙打旺(Astragalusadsurgens)懸浮細胞液中不添加和添加AsA時，MDA含量比分離前分別增加1.8倍和0.8倍，AsA對膜質(zhì)的過氧化具有抑制作用，能夠降低脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物MDA的含量，延緩細胞衰老，起到穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)、保護細胞的作用[60]。另外，研究報道[61-62]，AsA還可以抑制多酚氧化酶(PPO)的活性，防止果品加工過程中由于PPO而導致的果實褐變，對果品加工保存起到至關(guān)重要的作用。相似的結(jié)果在黃瓜[63]和閩楠(Phoebebournei)[64]種子研究中也有發(fā)現(xiàn)。

適宜濃度的AsA浸泡老化小麥種子后，種子發(fā)芽率、發(fā)芽力明顯增加，幼苗電解質(zhì)滲漏降低，MDA含量明顯減少，其中500 mg·L-1AsA處理效果最為顯著[65]，這說明AsA對老化后小麥種子脂質(zhì)過氧化有緩解作用。AsA還能夠使老化的辣椒(Capsicumannuum)等種子活力指數(shù)得到顯著提高[66]。

另外，AsA還能起到保護DNA，緩解大分子受傷的作用，如馬愛國和劉四朝[67]在用0.10和0.25 mmol·L-1AsA溶液培養(yǎng)Hela細胞41 h后，發(fā)現(xiàn)細胞抗氧化系統(tǒng)清除ROS的能力增強，細胞中DNA表現(xiàn)出較強的抗氧化損傷能力。

4 小結(jié)與展望

AsA作為植物細胞中存在的重要抗氧化物質(zhì)，研究者對其在植物體內(nèi)的合成途徑雖然有了很深的研究，并形成了幾種不同的AsA合成途徑論，但是究竟哪一種才是正確途徑還有待進一步研究。

AsA作為APx的輔酶，在植物抵抗逆境脅迫方面起著重要的抗氧化作用，有關(guān)其清除自由基的機理研究較多，主要集中在葉黃素循環(huán)和AsA-GSH循環(huán)上。同時，有關(guān)AsA在植物正常生長代謝過程包括細胞的分裂生長、細胞壁的伸長、參與光合作用和參與信號傳導等方面的研究也較為深入。

然而，有關(guān)AsA對植物抗氧化功能影響方面的研究多數(shù)集中在其對作物和蔬菜幼苗逆境脅迫下酶系統(tǒng)變化的作用上，而在牧草作物特別是牧草種子方面的研究較少。最新研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸過氧化物酶(APx)某個或某些基因的表達與AsA在植物抵抗逆境脅迫中的作用有關(guān)，若牧草或作物種子中也能夠找到某個基因來調(diào)控或緩解種子自然老化或劣變的過程，這將對種子貯藏、保存活力和延長壽命有很大的意義。因此，有關(guān)AsA在其他作物，包括飼料作物及牧草中的應用以及種子劣變過程中的生理機制還有待于進一步深入研究和探討。

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