高羊茅抗逆基因工程研究進展

楊沛艷,何亞麗,吳燕民

(1.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240)

高羊茅(Festucaarundinacea)，又稱葦狀羊茅，是禾本科(Graminea)羊茅屬(Festuca)寬葉亞屬(Subgen．Subulatae)早熟禾族多年生草本植物[1]。全世界羊茅屬植物100多種[2]，天然分布于整個美洲(北至斯堪的納維亞62° N)、北非、西亞和西伯利亞,后被引進北美、南美、澳大利亞、新西蘭和南非及東非。我國有20多種野生高羊茅，主要分布于四川的涼山、綿陽，貴州的西部及西北部海拔2 200 m以上的地區(qū)，在云南以滇東北和滇西北分布較多,多生于中山灌木草叢和亞高山草地、路旁、林下,海拔3 000～3 800 m之處[3]。西北、東北、華北地區(qū)、新疆伊利也有大面積高羊茅分布，多生于河谷草甸、山地草甸及山地草原。甘肅的高羊茅主要分布于甘南、臨夏、祁連山一帶,以海拔2 700～3 500 m的亞高山草甸、山坡、河谷、沙地為主。作為一種冷季型草坪草，高羊茅建坪成本低，建坪快，并且根系發(fā)達、色澤翠綠、綠期相對較長。目前,北京、上海、浙江、山東、江西、武漢、江蘇等地將高羊茅廣泛用于城市綠地規(guī)劃和球場建設。在美國，高羊茅應用也非常廣泛，年種植面積在1.87億～14.07億 hm2[4]。在抗逆方面，高羊茅具有較強的耐高溫、耐寒冷及抗病能力，是一種有潛力的草坪草。近十多年來高羊茅在我國草坪中的應用迅速增加。為此，就高羊茅近幾十年的發(fā)展作以綜述，并對其發(fā)展趨勢進行展望。

1 高羊茅抗逆基因工程再生體系的建立

通過高羊茅外植體誘導獲得愈傷組織并產(chǎn)生再生植株在國內(nèi)外已有不少研究[5-11]，研究者還對各種誘導激素濃度進行了優(yōu)化，最高誘導率在80%以上，但免不了白化苗的產(chǎn)生(表1)。相比之下，由懸浮細胞培養(yǎng)物獲得再生植株能降低白化苗的產(chǎn)生，但此法費時費力?；蛐筒町愐彩怯绊懻T導率及植株再生很重要的一個因素。高羊茅組織培養(yǎng)始于20世紀70年代，Philip[12]首先以高羊茅的分生組織為外植體，培育出高羊茅小植株。錢海豐和薛慶中[5]研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對高羊茅成熟胚誘導出愈率差別不大，相反，不同濃度2,4-D對出愈率影響比較顯著，并發(fā)現(xiàn)最適宜的2,4-D濃度為9 mg·L-1，出愈率達66.7%。余建明等[6]研究發(fā)現(xiàn)，2,4-D濃度為1.0 mg·L-1、6-BA濃度為0.5 mg·L-1時“家園”高羊茅愈傷組織誘導率最大。江巨鰲等[7]、李曉輝等[8]在余建明等[6]研究的基礎上對不同的激素濃度進行探索，發(fā)現(xiàn)2,4-D濃度為9 mg·L-1，6-BA濃度為2.0 mg·L-1時，誘導率最高，由之前的66.7%提高至70%。余桂紅等[9]在確立高羊茅適宜的最佳培養(yǎng)基及最適宜的激素濃度外，發(fā)現(xiàn)3.0 g·L-1Gelrite相比瓊脂更能提高愈傷組織誘導率及加快愈傷組織的生長，最高愈傷組織分化高達72.8%。王鋮等[13]研究發(fā)現(xiàn)高羊茅種子分化培養(yǎng)基以MS+4 mg·L-12,4-D+0.2 KT最佳。梁蕊芳等[10]研究發(fā)現(xiàn)從一端切的高羊茅種子下胚軸較從兩端切具有相對高的誘導率，加入適宜濃度(9 mg·L-1)的2,4-D時，愈傷組織誘導率高達80.7%。李志亮等[14]在前人研究的基礎上確立了高羊茅種子滅菌的最佳方式，使種子萌發(fā)率提高至80%，從而提高了愈傷誘導率。高羊茅種子的消毒程序以次氯酸鈉加無菌水攪拌去皮最佳[15]。王健等[11]的研究進一步證實了愈傷組織誘導培養(yǎng)基2,4-D的最佳濃度為9 mg·L-1，并確立了1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1為最佳生根培養(yǎng)基，生根率達100%。研究表明，成熟種子進行縱切后得到的半粒種子較完整種子具有更高的誘導率[16]。國內(nèi)外由胚性懸浮培養(yǎng)物獲得再生植株的例子也很多。Dalton[17]由高羊茅胚性懸浮培養(yǎng)物獲得再生植株。Zaghmout和Torello[18]由紫羊茅(F.rubra)胚性懸浮培養(yǎng)物獲得再生植株。Kasperbauer等[19]直接用高羊茅花藥進行培養(yǎng)，將幼穗接種在含2.0 mg·L-12,4-D的誘導培養(yǎng)基上，7周后獲得一批綠色小植株。Rose等[20]在草地羊茅(F.pratensis)上也獲得了花藥單倍體植株。

2 遺傳轉(zhuǎn)化

高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化開始于20世紀90年代初，轉(zhuǎn)化方法各不相同[21-27](表2)。其中基因槍法轉(zhuǎn)化的一個主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制，其最早在美國提出[28]，于1995年通過此方法獲得轉(zhuǎn)基因高羊茅植株[29]。梁蕊芳[21]在我國首次用此方法獲得含有AtNHX1基因和CBF3基因的轉(zhuǎn)基因耐鹽高羊茅株系。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法具有易選擇轉(zhuǎn)化體、避免產(chǎn)生嵌合體等優(yōu)點。Ha等[22]于1992年首次通過此方法獲得含有gusA基因和hph基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅植株。Kuai和Morris[23]用同樣的方法獲得含bar基因的可育抗性轉(zhuǎn)基因高羊茅苗。Dalton等[24]利用硅碳纖維介導轉(zhuǎn)化法成功將外源基因整合到高羊茅基因組中并得到表達。農(nóng)桿菌介導法以其費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨特優(yōu)點而備受科學工作者的青睞。Dalton等[24]通過此方法將hph基因和gusA基因成功導入高羊茅植株中。吳關庭[25]采用根癌農(nóng)桿菌介導法獲得含有CBF基因的耐鹽轉(zhuǎn)基因高羊茅植株，并發(fā)現(xiàn)其耐逆性得到增強。趙軍勝等[26]以4個高羊茅品種為受體，獲得含AtNHX1基因和nptⅡ基因的綠色抗性轉(zhuǎn)基因植株。同年，Hu等[27]通過此方法轉(zhuǎn)化高羊茅胚性懸浮細胞，建立了一整套穩(wěn)定、高效的高羊茅轉(zhuǎn)化體系。但農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法缺點是受基因型的限制。在有關高羊茅的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，轉(zhuǎn)化體大多采用潮霉素篩選，其次是用除草劑膦絲菌素。另外，確定最小的選擇壓力及最適宜的選擇時期是轉(zhuǎn)化成功的關鍵。

表2 高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化方法進展Table 2 Genetic transformation of tall fescue

3 抗逆基因工程及生理研究

干旱與鹽害等非生物脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，長期脅迫會造成植物生長緩慢至死亡。

高羊茅是目前我國使用量增長最快的草種，夏季的高溫環(huán)境及較大的需水量已成為限制其生長的主要因素，加之我國土壤鹽漬化日益嚴峻。因此，提高對環(huán)境的適應性是目前高羊茅育種的主要目標之一。高羊茅遺傳背景比較復雜，基因組較大，所以，和傳統(tǒng)育種相比，將抗逆相關優(yōu)良基因通過基因工程技術導入傳統(tǒng)高羊茅品種中，從而增強高羊茅抗逆性顯得尤為重要。

有相關研究表明，磷脂酰肌醇信號途徑(Phosphatidylinositol Pathway)在植物對抗旱耐鹽、高溫等脅迫應答過程中起重要作用，而磷脂酰肌醇合成酶(Phosphatidylinositol Synthase，PIS)以CDP-DG和myo-inositol為底物生成磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，Ptdlns)。徐國榮[30]從玉米(Zeamays)中克隆出ZmPIS基因并導入高羊茅品種，對轉(zhuǎn)基因植株進行耐旱耐鹽性分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株有較強的抗逆性。 Zhao等[31]從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中克隆出Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因ANHXI，構建含有35S啟動子的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因遺傳轉(zhuǎn)化高效表達載體，轉(zhuǎn)化高羊茅下胚軸，經(jīng)分析，植株耐鹽性明顯提高。Tang等[32]從高羊茅中分離出FaDREBI基因，對其進行生物信息學分析，并通過熒光定量PCR分析其低溫處理下根、莖、葉的表達量，發(fā)現(xiàn)其在低溫處理下葉中表達量較高，從而參與植株對低溫環(huán)境的響應。Cao等[33]將從擬南芥中分離的耐鹽相關基因AtHDGII,通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)入高羊茅下胚軸，發(fā)現(xiàn)高羊茅在干旱及鹽脅迫下，其生長發(fā)育無明顯變化，但根部丙二醛含量下降，Na+/K+交換無明顯變化，脯氨酸、過氧化氫酶活性增強，超氧化物歧酶合成加速，從而使植物抗鹽性提高。趙彤等[34]從高羊茅中克隆16S/trnA/23s片段，增加了酵母海藻糖耐旱相關基因tsp1,構建三價表達載體，轉(zhuǎn)化高羊茅幼嫩葉片，經(jīng)分析表明，發(fā)現(xiàn)其在葉綠體中有很好的表達，為提高高羊茅耐旱性奠定基礎。李志亮[35]將從擬南芥中分離的AtNHXI基因轉(zhuǎn)化高羊茅愈傷組織，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株能加快細胞質(zhì)中多余的Na+排進液泡來消除Na+的毒害，從而提高植株耐鹽性。吳關庭等[36]將耐逆相關基因轉(zhuǎn)化高羊茅胚性愈傷組織，分別對轉(zhuǎn)基因植株和對照植株進行低溫(-5 ℃)、高溫(45 ℃)、干旱(25 ℃不保濕)及2% NaCl處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株較對照植株有顯著生長優(yōu)勢，其相對電導率較對照低30%。證明轉(zhuǎn)基因植株耐逆性有所增強。張志飛[37]對14個受高溫干旱脅迫的高羊茅品種進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)在高溫干旱脅迫下，葉片蠟質(zhì)含量與植物水分利用率呈正相關，并首次將蠟質(zhì)相關基因?qū)?個高羊茅品種中，得到抗旱性增強的轉(zhuǎn)基因植株。趙汝等[38]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)DREB1A基因的高羊茅植株對鉛離子富集與轉(zhuǎn)運能力要強于對照。Dong等[39]通過分析高羊茅對葉斑病(Cercosporafestuca)和褐斑病(C.viticala)的感病機理，轉(zhuǎn)入AGLUI和青蛙表皮的SI基因，均能使高羊茅的抗病性得到增強。馬生健等[40]通過基因槍法將含有抗真菌病的幾丁質(zhì)酶基因Chi和B-1，3-葡聚糖酶基因Glu雙價表達載體轉(zhuǎn)入高羊茅愈傷組織，轉(zhuǎn)化株表現(xiàn)出較好的抗禾谷鐮刀菌病的能力。高羊茅蟲害危害較病害輕，目前轉(zhuǎn)入的抗蟲基因主要為Bt基因。在草坪雜草防除方面，草丁膦作為一種光譜性除草劑在國內(nèi)外使用非常廣泛，但其對草坪的毒害作用亦不能忽視，Bar基因可以使草丁膦的自由氨基乙酰化，減輕對植物的毒害，國內(nèi)外許多學者通過轉(zhuǎn)基因技術，獲得含Bar基因的轉(zhuǎn)基因高羊茅已不在少數(shù)。

4 存在問題及建議

我國是草坪草資源較豐富的國家之一，近幾年國內(nèi)外專家在高羊茅再生、基因工程、抗逆性方面的研究也越來越多，目前已獲得大量抗逆性增強的轉(zhuǎn)基因植株，為我國增添新的草種資源奠定了基礎。但存在一些問題：1)高羊茅體系再生研究仍不夠健全。出愈率不高，外植體僅僅局限于幼胚、幼穗、花藥等，再生率不穩(wěn)定，在組培方面對外源激素的作用機理及激素之間的相互作用尚不清楚，在外源激素的使用上太過盲目。2)高羊茅抗逆性的分子機制研究較少。3)高羊茅抗逆性的研究僅局限于對一些優(yōu)良基因的轉(zhuǎn)入，對轉(zhuǎn)基因后代抗逆性研究較少。 4)在基因工程方面，缺乏一些新思路。針對這些問題，提出幾點建議：1)在高羊茅愈傷再生方面，可通過確定分化的最有利時期來提高培養(yǎng)材料的分化率，提高愈傷組織再生率。在外植體的選擇上，除幼胚、幼穗外，可通過切胚乳來提高出愈率，還可以以根尖分生區(qū)為外植體獲得再生，且今后應在內(nèi)源激素和外源激素的相互作用方面深入研究，通過測定內(nèi)源激素的種類及水平來直接指導外源激素的添加。2)在植物對逆境的響應方面，應了解植物對逆境的適應、傷害、修復、補償?shù)淖晕艺{(diào)節(jié)過程，從分子水平上研究高羊茅抗逆性的生理功能及物質(zhì)基礎，通過基因手段進行改造，并結(jié)合育種手段培育抗逆性更全面的新品種。3)在獲得轉(zhuǎn)基因植株的基礎上，分析不同世代植株的表達情況。4)在傳統(tǒng)育種的基礎上，結(jié)合現(xiàn)代育種新思路，比如，多基因聚合育種、同效多基因育種、多態(tài)單基因育種、多細胞聚合育種、染色體加和育種，培育優(yōu)良草坪品種。

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