艾炷灸對兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性物質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9mRNA的影響

章海鳳,常小榮*,劉 密,岳增輝,謝 輝,劉未艾

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長沙 410007；2.郴州市第一人民醫(yī)院，湖南 郴州 423000)

基質(zhì)金屬蛋白酶是鋅離子依賴的一組蛋白水解酶(matrix metalloproteinases，MMP)，MMP主要功能為降解多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分，ECM成分主要有膠原蛋白、非膠原蛋白、蛋白聚糖以及彈力蛋白等,在靜態(tài)下ECM對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊起到支持、連接和保護(hù)的作用,而炎性細(xì)胞浸潤及炎性介質(zhì)的釋放能打破ECM的動(dòng)態(tài)平衡。動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理特征是血管壁慢性炎癥改變，受到致病源侵襲的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，吸引大量的炎癥細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮層，其分別釋放的各種細(xì)胞因子在斑塊形成、進(jìn)展和破裂中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。因此,ECM合成減少和降解增加，是斑塊破裂引發(fā)缺血事件的主要內(nèi)在原因，而基質(zhì)金屬蛋白酶對ECM的降解成為動(dòng)脈粥樣斑塊不穩(wěn)定的重要因素[1]。針灸用于改善動(dòng)脈粥樣硬化具有獨(dú)特的優(yōu)勢并取得了良好的臨床療效[2]，針灸還具有簡單易行、經(jīng)濟(jì)有效的特點(diǎn)，因此課題組進(jìn)一步提出：艾炷灸是否可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9表達(dá)的變化，從而達(dá)到穩(wěn)定粥樣斑塊的作用。這將為臨床合理應(yīng)用針灸治療干預(yù)本病的發(fā)生發(fā)展，提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康新西蘭大耳白兔60只，雌雄各半，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，3月齡，由湖南東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)檢證字2006-0001)，普通飼料由湖南東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。每只分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～70%。將60只兔隨機(jī)分為4組，每組15只，即：空白組(空白對照組)；模型組(AS模型組)；艾炷灸組(AS模型加艾炷灸)；西藥組(AS模型加阿托伐他汀)。

1.2 主要試劑 艾炷：選用蘇州東方艾絨廠生產(chǎn)的“神灸300灸”艾炷(型號(hào):東方1型，艾炷下有3 mm厚的紙制底盤，可直接黏于穴位上)，阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，國藥準(zhǔn)字號(hào)：H19990258，批號(hào)：090203440)；牛血清白蛋白、膽固醇(sigma)；卵清白蛋白、血脂試劑(羅氏)；膽酸鈉(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；2.5%戊二醛,2%鋨酸，50%、70%、90%、100%各濃度丙酮,Epon812環(huán)氧樹脂包埋液(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院超微結(jié)構(gòu)檢測中心配制)；原位雜交試劑盒(天津?yàn)笊锕?。

1.3 造模方法 除空白組外,其余3組均喂飼高脂飼料(在普通飼料中加15%蛋黃粉、5%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工成顆粒飼料),并于第1、3、5天各從耳緣靜脈注射牛血清白蛋白125 mg/kg體質(zhì)量，共3次；同時(shí)用卵清白蛋白進(jìn)行皮下注射，2.5 mg(kg·/次)，2天1次，共5次，空白組只喂普通飼料，每只兔進(jìn)食量按30 g/(kg·d)給予，并根據(jù)體質(zhì)量增減不斷調(diào)整進(jìn)食量。各兔均自由飲水,共飼喂16周，每周稱體質(zhì)量1次并記錄。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 艾炷灸組每天喂飼高脂飼料同時(shí)并進(jìn)行艾炷直接灸，第Ⅰ組選穴為巨闕及雙側(cè)天樞、豐隆共5穴，第Ⅱ組選穴為雙側(cè)心俞、肝俞及脾俞共6穴。取穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]及擬人比照法制定。取穴定位后剪毛，將直徑0.5 cm的艾炷直接黏于穴位上，點(diǎn)燃施灸，待艾炷燃完余熱散盡后再換另1壯。每穴連續(xù)灸3壯(約15～20 min),每日1次，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，連續(xù)治療16周；西藥組每天喂飼高脂飼料，并在高脂飼料中加入阿托伐他汀1 mg/(kg·d)；空白組每天喂飼普通飼料，不進(jìn)行任何干預(yù)；模型組每天喂飼高脂飼料，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法 兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)檢測，兔處死后,快速將主動(dòng)脈從根部分離至腹主動(dòng)脈分叉處斷離，取主動(dòng)脈弓下1.5～3.5 cm、長約2 cm的一段組織，縱向剪開攤平，放入4%多聚甲醛液內(nèi)固定，4 ℃保存。將固定后的組織材料進(jìn)行洗滌與脫水；進(jìn)行適當(dāng)?shù)耐该魈幚?；然后浸蠟與包埋；包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的方形或長方形,進(jìn)行貼片與烤片后待檢。采用原位雜交法檢測兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、MMP-9 mRNA的表達(dá)。取斑塊全部為目標(biāo)位置，每張玻片隨機(jī)取400倍照片5個(gè)視野。用IMAGE-PLUS-5.0軟件進(jìn)行灰度掃描，測定吸光度IA值，取其平均值進(jìn)行半定量分析(顏色標(biāo)準(zhǔn)H 7-50，S 0-255，I 0-128)。

2 結(jié)果

艾炷灸對兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9 mRNA表達(dá)的影響，見表1。

表1 艾炷灸對兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中MMP-2、9 mRNA表達(dá)的影響(±s) IA值

由表1可以看出：與空白組相比，模型組AS斑塊中MMP-2、9 mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明通過高脂飲食和免疫損傷成功建立了兔AS模型。與模型組相比,艾炷灸組和西藥組AS斑塊中MMP-9 mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸和西藥組能抑制兔AS斑塊中MMP-9的表達(dá)；與模型組相比，西藥組AS斑塊中MMP-2 mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而艾炷灸組AS斑塊中MMP-2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與西藥組相比AS斑塊中MMP-2、9 mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸抑制兔AS斑塊中MMPs表達(dá)的作用不如西藥組。

3 討論

AS的發(fā)病率隨著人們生活水平的提高不斷上升，而由此導(dǎo)致了大量的心腦血管疾病的發(fā)生，其中約70%～75%心腦血管疾病與AS易損斑塊破裂的形成密切相關(guān)，MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，MMPs可由AS斑塊內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等產(chǎn)生[4]，而基質(zhì)金屬蛋白酶中MMP-2,9對斑塊的不穩(wěn)定性關(guān)系非常密切[5]。易損斑塊由于其薄纖維帽、脂質(zhì)含量多，容易破裂并形成血栓，而AS血栓形成是導(dǎo)致心血管病癥發(fā)病和死亡的首要原因[6]。因此穩(wěn)定斑塊破裂成為防治急性心血管事件的重要目標(biāo)。

MMPs已成為心血管病治療的一個(gè)靶點(diǎn)[7],通過減少M(fèi)MPs的表達(dá)是心腦血疾病治療的新方向。在臨床應(yīng)用較多的是他汀類藥，但他汀類藥物可能會(huì)引起肝毒性和肌肉炎癥，而AS是慢性疾病，需要長期用藥，病人依從性較差，不利于病人病情的穩(wěn)定。目前人工合成的MMPs抑制劑如Marimastat(BB2516)[8]、GM6001[9]，具有抑制MMPs的作用，但藥物毒副作用較大，且特異性不強(qiáng)，并不能達(dá)到預(yù)期的效果。

針刺通過抑制內(nèi)源性MMP-9合成和分泌,在某種程度上可降低MMP-9相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，減輕MMP-9導(dǎo)致的基質(zhì)降解，使得相關(guān)病理過程如腦水腫、白細(xì)胞浸潤、血腫擴(kuò)大等得以緩解，達(dá)到拮抗腦損傷的作用[10]。針刺可降低MMP-2表達(dá)，減少腦水腫程度，起到保護(hù)腦組織的作用[11]。針灸在改善AS上能起到比較好的療效，本課題組在前期研究[12-14]中發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸對高脂血癥合并AS有肯定療效，具有降脂及抗動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷的作用，并且隔藥餅灸還具有穩(wěn)定粥樣斑塊的作用。因此，本次試驗(yàn)推測艾炷灸能否通過調(diào)節(jié)MMP-2,9的表達(dá)，達(dá)到穩(wěn)定粥樣斑塊、保護(hù)腦組織的作用，以豐富針灸治療AS的治療方法。

本次研究所選用的阿托伐他汀是目前臨床常用于治療AS的藥物，符合公認(rèn)、有效、可比的研究。研究結(jié)果表明，通過高脂飲食和免疫損傷已成功建立了兔AS模型，模型組MMP-2,9的表達(dá)明顯增高，說明了由炎性細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，這與Hangyuan Guo等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致；與模型組相比，艾炷灸能達(dá)到抑制兔AS斑塊中MMP-9的表達(dá)作用，相對阿托伐他汀藥物，艾炷灸抑制兔AS斑塊中MMPs表達(dá)的作用不明顯。說明艾炷灸對調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)有一定的作用，艾炷灸可用于穩(wěn)定粥樣斑塊，艾炷灸雖然沒有達(dá)到阿托伐他汀藥物的治療效果，但相對而言，艾炷灸具有毒副作用小、安全、簡便的優(yōu)勢，可用于豐富AS的治療手段。

本次實(shí)驗(yàn)中，艾炷灸對兔AS斑塊中MMP-2的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用。我們推測：針灸對AS的治療效果是肯定的，那么是否是艾炷灸灸炷大小、灸時(shí)沒有達(dá)到有效治療閾值，或者通過其他的信號(hào)途徑對AS起治療作用。在今后的研究中可以進(jìn)一步探討灸炷大小、灸時(shí)對MMP表達(dá)的影響；艾炷灸通過其他調(diào)節(jié)機(jī)制達(dá)到治療AS的目的。

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