β-環(huán)糊精-4-芐氧基苯酚包合物與DNA的相互作用*

龍 俊，段雷雨，王興明，楊 歡

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院化學(xué)系，四川 綿陽(yáng) 621010)

除了少數(shù)的病毒RNA之外，DNA也是生物體含有遺傳信息的物質(zhì)，而且是生物體內(nèi)非常重要的生物大分子，DNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著特別重要的作用，特別是在基因的表達(dá)方面，因此它是生物遺傳信息的基本載體。關(guān)于DNA的化學(xué)研究領(lǐng)域中，小分子化合物與DNA大分子的相互作用的研究是非常重要的，并且一直受到人們的關(guān)注。這是因?yàn)榘┌Y的化學(xué)治療方法最有效的方法就是直接針對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA[1-2]，在醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有人用這種方法來殺死癌細(xì)胞，如一些小分子抗癌藥物順鉑，核酸剪切試劑以及具有核酸結(jié)構(gòu)的熒光探針，還有一些功能小分子在特定堿基序列檢測(cè)中被用作雜交指示劑[3-4]。因此，對(duì)小分子與DNA之間作用的研究，在醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域都有著舉足輕重的作用。目前研究小分子與DNA之間相互作用的手段[5]：分光光度法、熒光法、光散射技術(shù)、電化學(xué)分析法以及生物學(xué)法。

超分子化學(xué)是一門迅速發(fā)展起來的熱門學(xué)科，超分子作用是一種以非共價(jià)鍵結(jié)合的分子間識(shí)別的相互作用力。在超分子化學(xué)中有三類物質(zhì)很受關(guān)注，分別是環(huán)糊精、冠醚以及杯芳烴，它們均是生物模型的分子化學(xué)，其中環(huán)糊精是其中最重要的一支。

環(huán)糊精(CD)是一類含有6個(gè)及以上的D-吡喃葡萄糖單元經(jīng)過α-1,4糖苷鍵首尾相連的鍵合作用形成的大環(huán)化合物。環(huán)糊精尤其具有內(nèi)疏水外親水的特殊結(jié)構(gòu)能使客體分子的一些物理及化學(xué)性質(zhì)發(fā)生部分改變。環(huán)糊精自身的結(jié)構(gòu)以及性能與酶具有的微環(huán)境相類似，因此能夠成為研究小分子與DNA相互作用的有效途徑之一[6-7]。本文研究了4-芐氧基苯酚(PBP)和β-CD形成的包合物與DNA的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

β-環(huán)糊精(β-CD，AR，成都科龍化工試劑廠)：溴化乙錠(EB，AR，Sino-American biotec 公司產(chǎn)品)；鯡魚精DNA(hsDNA)(上海海洋生物技術(shù)有限公司)；4-芐氧基苯酚(PBP，w≥99%，成都西亞化工股份有限公司)；寡聚核苷酸(堿基序列為5’-AATCTCTCGG-3’，大連寶生物工程有限公司)；Tris(0.25 mol/L)-HCl緩沖液(pH=7.4)臨時(shí)配制；水為二次重蒸水，其它試劑均為分析純。

F96-熒光分光光度計(jì)(上海分析儀器公司)；Nicolet 380智能傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)熱電尼高力公司)；D/max-RB X射線衍射儀(日本理學(xué)公司)；pHS-3B型酸度計(jì)(成都方舟科技開發(fā)公司)； HH-601超級(jí)恒溫水浴(金壇金南儀器廠)；AL204型電子分析天平(上海梅勒特-托利多儀器)；PHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；烏貝路德黏度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜法 所有樣品先用配制好的Tris-HCl緩沖液(pH=7.4)溶解配制成高濃度溶液搖勻，然后靜置，在使用的時(shí)候再稀釋成所需濃度。熒光滴定中精確量取3.00 mL待測(cè)溶液加到1 cm厚的比色皿中，并用注射針每次加入相同量10 μL溶液，因加入體積過小，可以忽略體積變化對(duì)熒光光譜的影響，測(cè)定和記錄每次滴定后溶液的熒光光譜。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)射光譜的掃描狹縫均為5 nm，掃描間隔均為1 nm，所有實(shí)驗(yàn)的激發(fā)波長(zhǎng)均為λex=441 nm。

Scatchard法[8]：配制一系列不同比例的小分子與DNA的混合溶液，其中DNA的濃度是不變的，每次比例均為Rt(Rt=[小分子]/[DNA]，Rt=0，0.4，0.8，1.2)，使用熒光探針EB分別滴定上述所配制溶液并記錄熒光光譜變化值[9]。

1.2.2 黏度法 在室溫下進(jìn)行，使用烏氏貝德黏度計(jì)進(jìn)行黏度法測(cè)量，將配制好的DNA溶液加入已經(jīng)干燥好了的黏度計(jì)中，將黏度計(jì)垂直固定好，然后浸泡在水浴中以保持溫度恒定，記錄DNA流下的時(shí)間，此過程中始終保持DNA濃度不變，試驗(yàn)中每次使用小分子滴定結(jié)束后，待溶液混合均勻后記下溶液流下的時(shí)間，平行測(cè)量3次，取平均值，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液流下時(shí)間均大于180 s。以小分子濃度為橫坐標(biāo)，以η/η0為縱坐標(biāo)作黏度變化圖，η為混合溶液相對(duì)黏度值，η0為DNA的相對(duì)黏度值。

1.2.3 包合物的制備 應(yīng)用摩爾比法得出包和比，將4-芐氧基苯酚與β-環(huán)糊精按1∶1的計(jì)量關(guān)系稱取并溶解在Tris-HCl緩沖液中，混合均勻，靜置24 h讓它們充分作用，得到β-環(huán)糊精-4-芐氧基苯酚包合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜法研究β-環(huán)糊精與PBP的包和作用

在研究超分子化學(xué)中主體與客體相互作用最常用的一種方法是熒光光譜法。倘使β-CD包和了PBP，β-CD會(huì)使得PBP的部分理化性質(zhì)發(fā)生一些變化，因此會(huì)造成PBP的熒光光譜峰強(qiáng)度的變化或者造成紅移等現(xiàn)象。當(dāng)PBP濃度保持不變的情況下，向PBP溶液中逐漸滴加β-CD溶液，記下PBP的熒光光譜變化的過程，如圖1所示，584 nm出的峰為PBP在激發(fā)波長(zhǎng)為441 nm時(shí)的特征熒光峰，當(dāng)β-CD溶液的不斷加入，584 nm處的熒光峰強(qiáng)度明顯減弱，再隨著β-CD濃度的增加，會(huì)觀察到熒光光譜峰強(qiáng)減小的幅度明顯逐漸降低，導(dǎo)致峰強(qiáng)度減小是因?yàn)镻BP與β-CD形成了包合物，在起始階段β-CD濃度很低，那么需要多少β-CD就能全部包和PBP然后形成β-CD-PBP包合物，然而隨著β-CD濃度的增加到一定值后，β-CD與PBP之間已經(jīng)接近包和比，那么被β-CD包和的PBP將不隨β-CD的加入而增加，故后面熒光值強(qiáng)度減小幅度會(huì)逐漸變小。為了得到β-CD與PBP的包和比，使用了摩爾比法，固定PBP濃度，在584nm處平行測(cè)定加入β-CD后引起的熒光值變化，作出摩爾比圖如圖2所示，由圖可知β-CD與PBP之間結(jié)合比例為1∶1，即包和比為nβ-CD∶nPBP=1∶1，再利用雙倒數(shù)曲線，即可以計(jì)算出β-CD包和PBP之間的包和常數(shù)為Kf= 7.39×103L·mol-1。

圖1 β-CD對(duì)PBP熒光光譜的影響Fig.1 Fluorescence spectra of PBP in different concentrations of β-CDcPBP=2.00×10-5 mol/L,cβ-CD=7.50×10-4 mol/L

圖2 PBP對(duì)β-CD的摩爾比圖Fig.2 Mole ratio plots of β-CD-STcPBP=2.00×10-5 mol/L,cβ-CD=7.500×10-4 mol/L

2.2 熒光光譜法研究β-CD-PBP包合物與DNA的相互作用

在研究小分子與DNA作用中使用熒光光譜法[10-11]，若對(duì)象小分子能夠嵌入至DNA堿基對(duì)中，則導(dǎo)致小分子的熒光發(fā)射光譜減弱；若小分子與DNA的作用方式為靜電方式，會(huì)導(dǎo)致小分子的熒光發(fā)射光譜增強(qiáng)，原因是在嵌插作用過程中，β-CD-PBP中PBP的芳香發(fā)色團(tuán)嵌入到DNA堿基對(duì)之后出現(xiàn)π電子的堆積效應(yīng)造成的，然而靜電作用使得β-CD-PBP-DNA表面的電子密度增加從而導(dǎo)致熒光光譜增強(qiáng)。往β-CD-PBP溶液中逐漸滴加DNA溶液，然后掃描β-CD-PBP的熒光光譜變化的過程(圖略)，觀察熒光值變化并記下在逐漸滴加DNA后β-CD-PBP在584 nm處的熒光強(qiáng)度，作出摩爾比圖，結(jié)果如圖3所示，從圖3易可知由于加入DNA后，得知β-CD-PBP在584 nm處的熒光值不斷減少，說明β-CD-PBP與DNA之間相互發(fā)生了作用然后形成了一種新的復(fù)合物[12]，因此β-CD-PBP可能嵌插入了DNA之中。再根據(jù)圖3所示，β-CD-PBP與DNA之間的結(jié)合比為nDNA∶nβ-CD-PBP= 1∶9。

圖3 β-CD-PBP對(duì)DNA的摩爾比圖Fig.3 Mole ratio plots of β-CD-PBP-DNAcβ-CD-PBP=2.00×10-6 mol/L,cDNA=1.00×10-4 mol/L

圖 4 雙倒數(shù)圖Fig.4 Double reciprocal plotscβ-CD-PBP=2.00×10-6 mol/L,cDNA = 1.00×10-4 mol/L

2.3 β-CD-PBP包合物與DNA的相互作用間的熱力學(xué)研究

2.4 EB探針法研究PBP包合物與DNA之間的相互作用

在探索小分子與DNA之間的相互作用時(shí)，檢測(cè)小分子與DNA之間是否存在嵌插作用時(shí)通常用EB作為熒光探針。因?yàn)榫哂衅矫婀曹椊Y(jié)構(gòu)的EB，其能專一的嵌入至DNA堿基對(duì)中，當(dāng)EB嵌入至DNA中，由于DNA的內(nèi)部存在疏水環(huán)境，得知水溶液對(duì)EB的熒光猝滅作用將被削弱，那么EB-DNA的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于單獨(dú)的EB溶液。若目標(biāo)小分子與DNA之間存在著嵌插作用，則小分子將會(huì)和EB競(jìng)爭(zhēng)與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果會(huì)置換出EB，將會(huì)顯現(xiàn)水溶液對(duì)EB的熒光猝滅作用，此時(shí)熒光強(qiáng)度將會(huì)明顯地減弱。但是小分子以其它方式與DNA作用時(shí)，不能置換出EB，固熒光強(qiáng)度將保持不變。配制EB-DNA溶液并使它的濃度保持不變，在EB-DNA溶液中緩慢滴加β-CD-PBP溶液，記錄觀察EB-DNA熒光光譜變化(圖5)，從圖中可以明顯觀察到溶液中β-CD-PBP的濃度慢慢增加時(shí)，EB-DNA的熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸減弱，其結(jié)果表明β-CD-PBP置換出了DNA中的EB，進(jìn)一步說明包合物β-CD-PBP與DNA之間存在著嵌插作用，即包合物β-CD-PBP會(huì)嵌入到DNA中。

2.5 磷酸鹽與PBP包合物之間相互作用的研究

圖5 β-CD-PBP對(duì)EB-DNA體系的熒光光譜影響Fig.5 Effect of β-CD-PBP on fluorescence spectra of DNA-EBcEB-DNA=1×10-5 mol/L, cβ-CD-PBP=2×10-4 mol/L

圖6 磷酸鹽對(duì)β-CD-PBP的熒光光譜影響Fig.6 Fluorescence spectra of β-CD-PBP in different concentration of phosphatecNa3PO4=6×10-3 mol/L, cβ-CD-PBP=2×10-4 mol/L

圖7 寡聚核苷酸對(duì)β-CD-PBP的熒光光譜影響Fig.7 Fluorescence spectra of β-CD-PBP in different concentration of oligodeoxynucleotides cβ-CD-PBP=1×10-6 mol/L, coligodeoxynucleotides=1×10-5 mol/L

2.6 寡聚核苷酸與PBP包合物之間相互作用的研究

通過磷酸鹽實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PBP包合物與DNA之間的確存在靜電作用，β-CD-PBP與DNA之間是否存在溝渠作用可以通過寡聚核苷酸對(duì)β-CD-PBP熒光光譜影響結(jié)果來推測(cè)。寡聚核苷酸是DNA分子中的一個(gè)短小的鏈狀片段，也就是DNA雙螺旋堿基對(duì)中的一段短小的單鏈堿基。寡聚核苷酸沒有成對(duì)的堿基對(duì)，也沒有DNA外層的磷酸骨架，則小分子只能在它的溝壑中與其發(fā)生作用，這種作用方式就是溝渠作用。寡聚核苷酸對(duì)β-CD-PBP的熒光光譜影響結(jié)果在圖7所示，圖中明顯表明當(dāng)在β-CD-PBP溶液中加入了適量的寡聚核苷酸之后，熒光光譜幾乎沒有任何變化，然后考慮到實(shí)驗(yàn)和儀器帶來的誤差，可以認(rèn)為包合物β-CD-PBP的熒光光譜確實(shí)沒有發(fā)生變化，即表明寡聚核苷酸與β-CD-PBP包合物沒有發(fā)生作用，因此結(jié)果證明了包合物β-CD-PBP與DNA之間不存在溝渠作用。

2.7 β-CD-PBP包合物與DNA相互作用的黏度法研究

前面采用的方法一直是熒光光譜法來研究β-CD-PBP包合物與DNA的相互作用，意識(shí)到單一技術(shù)的可靠性，固選取流體力學(xué)——黏度法研究β-CD-PBP包合物與DNA之間的作用方式。引起DNA濃度變化的原因有其結(jié)構(gòu)的變長(zhǎng)扭結(jié)縮短變形等，而且這種變化非常的敏感，當(dāng)檢測(cè)時(shí)很難獲得精確的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)時(shí)，通常黏度法就是一種非?？煽慷行У姆椒?。整個(gè)小分子完全的嵌入到DNA中時(shí)，會(huì)使得堿基對(duì)之間的空間距離變大使得DNA分子鏈變長(zhǎng)，黏度就會(huì)顯著增加，若小分子與DNA表面的磷酸骨架發(fā)生靜電作用，而與堿基間的溝壑發(fā)生溝渠作用，這兩種作用方式對(duì)DNA的結(jié)構(gòu)并不產(chǎn)生影響，黏度值也不會(huì)發(fā)生變化。小分子若是部分的嵌入到了堿基對(duì)間，此時(shí)小分子會(huì)通過其他作用方式或者通過分子間相互作用力使得DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲變形從而導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)變短，此時(shí)它的黏度值就會(huì)變小[15]。配制一系列不同濃度并且包含不同比例的β-CD-PBP包合物的β-CD-PBP-DNA溶液，條件為室溫，分別測(cè)定其黏度并記錄，分析結(jié)果如圖8，探究β-CD-PBP對(duì)于DNA的黏度影響。從圖8中可以看出，溶液中包合物β-CD-PBP的濃度不斷增大的同時(shí)，可是DNA的黏度值在不斷的減小，此現(xiàn)象就說明β-CD-PBP分子只是部分嵌入到了DNA堿基對(duì)中。通常情況要完全嵌入到DNA堿基對(duì)中是要求小分子為平面共軛剛性結(jié)構(gòu)，可是環(huán)糊精因?yàn)槭且粋€(gè)筒狀結(jié)構(gòu)卻不能嵌入到堿基對(duì)中，那么嵌入到堿基對(duì)中的那小部分應(yīng)為PBP中完全進(jìn)入CD空腔的部分。所以，包合物β-CD-PBP與DNA之間的結(jié)合方式是以部分嵌插作用方式結(jié)合。

圖8 β-CD-PBP對(duì)DNA的黏度影響Fig.8 Influence of concentration of β-CD-PBP on DNA viscosity cDNA=7×10-5 mol/L

2.8 Scatchard法分析研究

Scatchard法是根據(jù)熒光探針法再結(jié)合Scatchard方程分析小分子與DNA相互作用的方法。因此分析EB存在下Scatchard圖有相同的K值說明包合物β-CD-PBP與DNA之間為非嵌插作用模式，即作用方式可能為溝渠作用或者靜電作用，若測(cè)得Scatchard圖中的n值和K值均不同說明包合物β-CD-PBP與DNA之間為嵌插作用和非嵌插作用均有的混合作用模式[15]。從表1明顯得出n值和K值均不同，故β-CD-PBP與DNA之間作用方式為混合作用。

在Scatchard法中，我們還使用兩種不同濃度的NaCl實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)溶液中的離子強(qiáng)度不同可以判斷出物質(zhì)與DNA之間是否有靜電作用。

因?yàn)镹aCl在緩沖溶液中將自發(fā)電離出Na+，Na+因?yàn)榕cDNA的磷酸骨架負(fù)離子作用在磷酸負(fù)離子周圍形成緊密陽(yáng)離子氛以至于小分子很難通過靜電結(jié)合與DNA作用，這樣也就抑制了小分子與DNA之間的靜電作用，使得在高濃度NaCl溶液中中的n值小于低濃度時(shí)的n值。因此在表1中0.5 mol/L的NaCl溶液的n值低于0.1 mol/L的NaCl溶液的n值，結(jié)果證明包合物β-CD-PBP與DNA之間存在著靜電作用。

表1 β-CD-PBP與DNA相互作用的Scatchard 方程Table 1 Scatchard Equation of interaction between β-CD-PBP and DNA

3 結(jié) 論

本文研究PBP與β-CD以及β-CD-PBP與DNA的相互作用主要采用熒光光譜法和黏度法，通過一系列實(shí)驗(yàn)得知PBP與β-CD能形成1∶1的包合物β-CD-PBP。而且包合物β-CD-PBP能與DNA作用形成一種9∶1的新的復(fù)合物，這種復(fù)合物的生成主要是通過部分嵌插和靜電作用的混合模式。熒光光譜法、探針法以及黏度法均驗(yàn)證了包合物β-CD-PBP與DNA存在部分嵌插，磷酸鹽實(shí)驗(yàn)法和Scatchard法驗(yàn)證了靜電作用，寡聚核苷酸法證明作用方式不存在溝渠作用。

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