升麻的¹H—NMR指紋圖譜—模式識別研究

沈莉，趙燕燕，謝洪平，劉萬卉

[摘要] 目的：建立一種基于¹H-NMR指紋圖譜-模式識別的不同品種升麻的鑒別方法。方法：以¹H-NMR技術(shù)測定升麻中三萜皂苷類特征提取物的信息，并轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，采用化學(xué)模式識別方法中的主成分分析（PCA）及判別偏最小二乘（DPLS）法進(jìn)行識別分析。結(jié)果：¹H-NMR指紋圖譜-模式識別能夠有效地鑒別不同品種的升麻樣本。結(jié)論：¹H-NMR指紋圖譜-模式識別是一種有效的藥材分類鑒別方法，可以作為藥材質(zhì)量控制的手段之一。

[關(guān)鍵詞] 升麻；¹H-NMR指紋圖譜；模式識別；主成分分析；判別偏最小二乘；三萜皂苷

升麻是典型的多基源藥材，我國境內(nèi)有升麻屬植物8種，僅作為正品升麻而被2010年版《中國藥典》所收載的就有3種，包括升麻Cimicifuga foetida L.（西升麻）、大三葉升麻C. heracleifolia Kom.（關(guān)升麻）和興安升麻C. dahurica （Turcz.） Maxim.（北升麻）[1]。

化學(xué)研究表明，升麻屬植物的主要成分為9， 19-環(huán)菠蘿蜜烷型四環(huán)三萜及其苷類，迄今為止，已從各種升麻中分離得到近200種三萜皂苷類化合物[2-3]，以西升麻為原料的三萜總皂苷提取物制劑已成功在國內(nèi)上市，用于女性圍絕經(jīng)期綜合征的治療[4-5]。在其原料藥材質(zhì)量評價(jià)和控制過程中不可避免地要涉及升麻品種鑒別的問題，由于西升麻中不含或幾乎不含阿魏酸和異阿魏酸[6-7]，采用2010年版《中國藥典》方法顯然不能滿足其品種鑒別的要求。本研究以升麻中的三萜皂苷類化合物為對象，首次采用¹H-NMR指紋圖譜結(jié)合模式識別的方法對升麻進(jìn)行研究，以¹H-NMR為識別變量，運(yùn)用多種數(shù)據(jù)分析方法建立了不同品種升麻的識別模型，為升麻的品種鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供了一種行之有效的控制手段。

1 材料

升麻藥材（表1）均采自甘肅隴南地區(qū)及四川九寨地區(qū)，大三葉升麻和興安升麻均購自產(chǎn)地。所有藥材均經(jīng)煙臺大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室趙燕燕副教授鑒定。

Bruker AV400型核磁共振波譜儀，QYJ直切式切片機(jī)，SF-300高速粉碎機(jī)，SK1200H超聲清洗機(jī)，LP5-2A型低速離心機(jī)，HSC-24A型氮吹儀，F(xiàn)DU-1100型冷凍干燥機(jī)。氘代吡啶（CIL公司），甲醇（分析純，天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 甲醇提取物的制備

藥材稱重后用切片機(jī)進(jìn)行切片，篩去泥土和須根，用高速粉碎機(jī)將藥材粉碎，經(jīng)充分研磨后過65目篩，取適量樣品置于烘箱中，75 ℃下烘3 h后稱取1.0 g干燥粉末置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 70%甲醇，超聲提取30 min后以3 000 r·min^-1離心10 min，取上清液在氮吹儀中揮干甲醇，加入適量蒸餾水，混勻后冷凍干燥，凍干粉末置于干燥器中避光保存。

2.2 ¹H-NMR測定及圖譜處理

準(zhǔn)確稱取升麻甲醇提取物凍干粉末20 mg置于5 mm核磁管中，加入0.5 mL氘代吡啶溶解后進(jìn)行¹H-NMR測試。測試用脈沖序列為noesypr1d，譜寬為8 000 Hz，掃描次數(shù)128次，采樣時(shí)間為4.09 s，弛豫時(shí)間為10 s，混合時(shí)間為0.6 s，溫度為25 ℃，在δ 6.04處壓制水峰。

通過核磁共振譜儀自帶的XWIN-NMR3.5軟件進(jìn)行傅里葉變換，氘代吡啶在¹H-NMR譜中呈現(xiàn)3個(gè)溶劑峰，將中間的溶劑峰定標(biāo)為δ 7.57，手動(dòng)調(diào)整相位后保存。將此FID文件導(dǎo)入MestReNova軟件，調(diào)整基線后，將最低場的溶劑峰（δ 8.77～8.67）峰面積定為1，從δ 6.95到δ 0.00以0.01為間隔進(jìn)行積分，產(chǎn)生695個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

2.3 模式識別方法

模式識別是化學(xué)計(jì)量學(xué)研究中十分重要的內(nèi)容，通過對復(fù)雜的化學(xué)量測數(shù)據(jù)的分析而揭示物質(zhì)的隱含性質(zhì)。本研究綜合運(yùn)用了多種模式識別方法對¹H-NMR指紋圖譜所提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析研究。所有模式識別分析均通過Matlab 7.0軟件完成。

2.3.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 主成分分析是最為常用的一種數(shù)據(jù)壓縮方法，以最優(yōu)化方法濃縮及綜合測量矩陣中的信息，減少數(shù)據(jù)集維數(shù)的同時(shí)保留數(shù)據(jù)集中對方差貢獻(xiàn)最大的特征。主成分分析產(chǎn)生2個(gè)矩陣，得分矩陣和載荷矩陣。得分矩陣的行和列分別代表主成分（PCs）和不同的樣品，通過得分矩陣的前2或3個(gè)主成分作圖，可以獲得直觀的二維或三維聚類圖，從而方便地對不同類別進(jìn)行判定。載荷矩陣的每1列對應(yīng)1個(gè)主成分，其中的每1數(shù)值均代表該主成分與原始變量的相關(guān)。對每1列作圖，即獲得該主成分的載荷圖，可以在一定程度上反映引起聚類的相關(guān)化學(xué)成分[8]。

2.3.2 判別偏最小二乘法（discriminant partial least square，DPLS） 判別偏最小二乘法是一種基于偏最小二乘回歸（partial least square regression，PLSR）的穩(wěn)健的判別分析方法，是一種有監(jiān)督的模式識別方法，特別適合于解釋變量數(shù)多且存在多重共線性，樣本觀測數(shù)少且干擾噪聲大的情況。采用DPLS法對樣本的¹H-NMR譜進(jìn)行分析時(shí)，該法可以同時(shí)對氫譜矩陣和類別矩陣進(jìn)行分解，加強(qiáng)類別信息在氫譜分解時(shí)的作用，以提取出與樣本類別最相關(guān)的波譜信息，即最大化提取不同類別波譜之間的差異，因此PLS方法通常可以得到比PCA方法更優(yōu)的分類和判別結(jié)果[9]。

3 結(jié)果與討論

3.1 升麻¹H-NMR指紋圖譜的建立

由典型的西升麻、關(guān)升麻和北升麻樣品的¹H-NMR譜圖（圖1）可知三者具有高度的相似性，譜峰主要分布在δ 0.0～6.4，以環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷及糖類化合物的信號為主[10]。其中δ 0.85為19位環(huán)丙烷亞甲基中一個(gè)質(zhì)子的特征信號，δ 0.8～1.5為三萜母環(huán)上角甲基的共振信號，δ 1.0～3.2則為三萜母環(huán)上亞甲基和次甲基質(zhì)子的吸收峰，δ 3.5～5.2還有三萜母環(huán)上部分化學(xué)位移靠近低場的質(zhì)子以及羥基質(zhì)子的信號，δ 5.2～5.7則為某些三萜皂苷環(huán)上雙鍵的烯氫質(zhì)子信號。糖類化合物的質(zhì)子信號則出現(xiàn)在δ 4.0～6.4，其中δ 4.1～5.3為糖環(huán)上質(zhì)子信號，δ 6.2處的雙峰為糖端基質(zhì)子的信號。而在δ 6.4～9.0低場區(qū)域，扣除吡啶的溶劑峰，其余多為某些酚酸類或色酮類化合物中部分芳?xì)滟|(zhì)子信號。

譜圖同時(shí)也展示了3種升麻因化學(xué)成分組成差異以及主要類似成分間相對含量不同而產(chǎn)生的某些化學(xué)位移及信號強(qiáng)弱的差別。與西升麻相比，關(guān)升麻和北升麻的¹H-NMR譜圖中皂苷類化合物的信號強(qiáng)度明顯較低，而糖類、酚酸類及色酮類化合物的信號強(qiáng)度則略高。顯然，關(guān)升麻和北升麻中三萜皂苷類物質(zhì)的含量低于西升麻，而糖類、酚酸類及色酮類化合物的含量則相對較高。

3.2 西升麻與關(guān)升麻、北升麻的鑒別

為便于討論，本研究將所有樣本分為2類，第一類為西升麻樣本，第二類為東北升麻樣本，包括關(guān)升麻和北升麻。

3.2.1 主成分分析（PCA） PCA方法是一種簡單而行之有效的數(shù)據(jù)壓縮方法，本研究首先采用此法對所有樣本的¹H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，前3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到87.2%，說明這3個(gè)主成分已經(jīng)可以對85%以上的原變量信息進(jìn)行解釋，故選取這3個(gè)主成分進(jìn)行得分圖和載荷圖的分析。

前3個(gè)主成分共同表征而成的三維PCA得分圖（圖2），可以清楚地看到西升麻和東北升麻各自聚集成一類，2類樣本之間界限清晰，無相互重疊。說明2類升麻之間確實(shí)存在差異，而PCA方法可以利用這種差異對其進(jìn)行區(qū)分。從PC1/PC2，PC1/PC3所作的二維得分圖（圖3），考察這3個(gè)主成分對于樣本區(qū)分的意義。圖3顯示，西升麻與東北升麻在PC1水平上的區(qū)別最為顯著：前者全部聚集在PC1得分值較小或?yàn)樨?fù)值的區(qū)域，而后者則分散在PC1得分值相對較大的區(qū)域。與之相類似，西升麻的PC3得分值也相對較小，但由于東北升麻在PC3水平上的分布范圍較廣，故無法與西升麻產(chǎn)生明顯的區(qū)別。無論是西升麻還是東北升麻，其PC2得分值均在較大范圍內(nèi)分散分布，沒有明顯的聚集。由此可見，PC1是西升麻與東北升麻分類的富信息變量，而PC2和PC3對該分類沒有顯著的差異，僅僅依賴PC1或PC1/PC2和PC1/PC3均不能獲得理想的分類效果。因此，本研究采用PC1/PC2/PC3作為西升麻與東北升麻的分類識別變量，可獲得理想的分類效果。

通過對PC1和PC2的載荷分析，可以考察引起2類升麻樣本之間區(qū)分的因素。主成分的載荷圖中，負(fù)峰意味著對主成分分類圖中得分為負(fù)的貢獻(xiàn)大，反之，正峰則對主成分中得分為正的貢獻(xiàn)大。

分別對PC1和PC2做載荷分析，可獲得與¹H-NMR譜圖類似的載荷圖（圖4），能夠?qū)⑦@些變量與相關(guān)的化學(xué)位移值一一對應(yīng)起來，從而更為方便地觀察引起PCA分類的相關(guān)化學(xué)成分。圖4顯示，δ 0.5～3.0的變量在縱軸上的投影均為負(fù)值，該化學(xué)位移區(qū)間對應(yīng)升麻中三萜皂苷苷元質(zhì)子的出峰區(qū)域，表明皂苷類化合物的貢獻(xiàn)使PC1得分為負(fù)值。其中在縱軸上的投影值最大的變量所對應(yīng)的化學(xué)位移為δ 0.75～0.88及δ 1.05～1.40，前者對應(yīng)19位亞甲基其中一個(gè)質(zhì)子的信號，后者為三萜母核上多個(gè)角甲基質(zhì)子的信號。而δ 4.0～5.2的變量在縱軸上的投影則均為正峰，但強(qiáng)度較弱，表明糖類化合物的貢獻(xiàn)使PC1得分為正值，但對PC1影響較小。載荷正值較大的變量主要來自化學(xué)位移為δ 4.05～5.15，而載荷負(fù)值較大的變量來自化學(xué)位移為δ 1.25～1.35，3.6～3.9，5.35～5.55等，根據(jù)化學(xué)位移區(qū)間所對應(yīng)的化合物類別，可知糖類化合物的貢獻(xiàn)使PC2得分為正，而皂苷類化合物的貢獻(xiàn)使PC2得分為負(fù)。

由此可見，皂苷類成分是引起PCA分類的主要化學(xué)成分，即西升麻與東北升麻之間的差異主要體現(xiàn)在所含皂苷類化合物的量上。與東北升麻相比，西升麻大多處于PC1為負(fù)的區(qū)域，表明其三萜皂苷類成分的含量較高而糖類化合物的含量略低，這與3種升麻的¹H-NMR譜圖對比結(jié)果一致。

對于關(guān)升麻和北升麻而言，比較其¹H-NMR圖譜可以發(fā)現(xiàn)，二者之間的相似性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其與西升麻的相似性。PCA分類研究也證實(shí)了這一點(diǎn)：圖3顯示，無論是在PC1，PC2還是PC3水平上，2種升麻樣本均交叉錯(cuò)落分布，二者之間存在明顯的重疊。顯然，關(guān)升麻和北升麻之間不存在顯著差異。

3.2.2 判別偏最小二乘（DPLS）分析 判別偏最小二乘（DPLS）法是一種有監(jiān)督的模式識別方法，不僅可以獲得優(yōu)于PCA方法的分類結(jié)果，還可預(yù)測未知樣本的類別。本研究通過DPLS方法建立不同品種升麻的判別模型，從而實(shí)現(xiàn)西升麻與東北升麻的快速檢測。

每一類升麻樣本都被隨機(jī)地分為2個(gè)集合，即校正集和預(yù)測集。西升麻的校正集中有25個(gè)樣本，預(yù)測集中有13個(gè)樣本；東北升麻則分為20個(gè)校正集樣本和10個(gè)預(yù)測集樣本。首先將校正集樣本作為標(biāo)準(zhǔn)樣本，應(yīng)用偏最小二乘回歸方法建立校正模型，然后將未參與建模的剩余樣本作為預(yù)測樣本，將其¹H-NMR數(shù)據(jù)代入模型中進(jìn)行分析。

分析結(jié)果顯示，以PC1和PC2所作的得分圖（圖5）對2類樣本具有良好的區(qū)分效果。所有的西升麻樣本都團(tuán)聚在一個(gè)較小的區(qū)域之內(nèi)，分布較為集中，相比之下，由于將關(guān)升麻和北升麻合并作為一類樣本進(jìn)行分析，所以該類樣本的離散性相對較大，分布范圍也較廣。這一結(jié)果說明西升麻樣本之間的差異較小，預(yù)示其質(zhì)量較為穩(wěn)定；而關(guān)升麻和北升麻組成的一類樣本之間的差異則較大，表明它們之間的質(zhì)量差異較大。

以圖5中所繪虛線為界，西升麻和東北升麻明顯地被區(qū)分為2類，彼此間能夠很好地分離且不存在類間重疊，表明所建立的識別模型具有良好的分離度。同時(shí)，每一類的預(yù)測集樣本都能夠準(zhǔn)確地落在校正集的分布范圍之內(nèi)，也不存在明顯的過擬合現(xiàn)象，表明該模型能夠準(zhǔn)確判斷升麻類別，對預(yù)測集樣本的正確識別率為100%，并且具有良好的穩(wěn)健性，從而保證了該方法對于未知升麻品種判別的重復(fù)性。

4 結(jié)論

升麻屬植物中普遍含有三萜皂苷、酚酸及色酮類化合物，然而不同品種升麻中這些成分的組成及含量存在較大差異，研究表明，西升麻中三萜化合物的含量明顯高于關(guān)升麻和北升麻[11-12]。因此，以三萜皂苷類化合物為主要有效成分，臨床用于圍絕經(jīng)期綜合征等內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病治療時(shí)，關(guān)升麻和北升麻不能代替西升麻。為確保藥物臨床安全有效，必須嚴(yán)格控制原料藥材的質(zhì)量，有關(guān)升麻品種的有效鑒別也就顯得尤為重要。升麻中三萜皂苷類化合物的¹H-NMR指紋圖譜能夠提供大量豐富的信息，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行升麻的品種鑒別和質(zhì)量控制無疑更為真實(shí)可靠。

本研究以¹H-NMR為識別變量，運(yùn)用PCA和DPLS方法對不同品種的升麻樣品進(jìn)行分析，均可實(shí)現(xiàn)西升麻與東北升麻（包括關(guān)升麻和北升麻）的分類。PCA得分及載荷分析表明，西升麻樣本和東北升麻樣本之間有明顯區(qū)別（在PC1水平上），三萜皂苷類化合物是引起這一區(qū)分的主要化學(xué)成分，此類化合物在西升麻中的含量較高，而在東北升麻中所含糖類等成分的量則較高。通過DPLS方法則可建立穩(wěn)健的識別模型，該模型具有良好的分離度和穩(wěn)定性，預(yù)測準(zhǔn)確率可達(dá)100%，能夠?qū)崿F(xiàn)西升麻樣本和東北升麻樣本之間的快速、準(zhǔn)確分類。

以三萜皂苷類化合物為對象的¹H-NMR指紋圖譜-模式識別方法是基于藥材特征性總成分的分析方法，其結(jié)果能夠更為真實(shí)地反映藥材的內(nèi)在品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)不同品種升麻的有效、快速鑒別，是較現(xiàn)有藥典方法更為科學(xué)、準(zhǔn)確的鑒別方法。

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Classification of Cimicifuga species based on ¹H-NMR fingerprint

combined with pattern recognition technique

SHEN Li1， ZHAO Yan-yan2， XIE Hong-ping3， LIU Wan-hui2*

（1. School of Medicine and Pharmacy， Ocean University of China， Qingdao 266003， China；

2. School of Pharmacy， Yantai University， Yantai 264005， China；

3. College of Pharmaceutical Sciences， Soochow University， Suzhou 215123， China）

[Abstract] The metabolomic analysis of three Cimicifuga species was performed using ¹H-NMR spectroscopy and pattern recognition （PR） techniques. A broad range of metabolites could be detected by ¹H-NMR spectroscopy without any chromatographic separation. The analysis using principal component analysis （PCA） and discriminant partial least square （DPLS） of the ¹H-NMR spectrum showed a clear discrimination between C. foetida and the other two species. The major metabolites responsible for the discrimination were triterpenoid saponins and saccharides. These results indicated that the combination of ¹H-NMR and PR provides a useful tool for chemotaxonomic analysis and authentification of Cimicifuga species， and could used for the quality control of plant materials.

[Key words] Cimicifuga； ¹H-NMR fingerprint； pattern recognition； principal component analysis （PCA）； discriminant partial least square （DPLS）； triterpenoid saponin

doi：10.4268/cjcmm20130215

[責(zé)任編輯 孔晶晶]