狗頭棗葉片原生質體分離研究

齊向英，陳宗禮，薛 皓，劉航娟，行文珍，謝 路

［陜西省紅棗重點實驗室(延安大學)，延安大學 生命科學學院，陜西 延安716000］

棗(Ziziphus jujube Mill.)屬于鼠李科(Rham naceae)棗屬(Ziziphus Mill.)植物。紅棗素有“天然維生素丸”之美稱，其所含的維生素不僅種類多，而且含量高。鮮棗維生素C 的含量是蘋果的75 倍，桃子的80 ～100 倍［1］。狗頭棗果實卵圓形或錐形，似狗頭狀，有“棗中狀元”的美名。這不只是因為它的種植效益好，關鍵是狗頭棗的維生素、粗纖維、磷、鐵等多種微量素的含量居各類紅棗之首［2］。陜北地區(qū)盛產的狗頭棗，其果實大、品質好、為優(yōu)良鮮食制干兼用棗品種，平均單果重18.79 g，果實較整齊，外形美觀，果皮中厚，褐紅色，果肉細脆、葉液中多，味酸甜，適宜鮮食和制干。近年來狗頭棗的研究報道逐漸增多，這些報道集中狗頭棗的形態(tài)解剖學研究、組培快繁、多倍體育種等方面。但有關狗頭棗原生質體分離至今未見報道。本文研究的目的是通過正交設計探索狗頭棗葉片原生質體分離的最佳酶液濃度和甘露醇濃度，為狗頭棗葉片原生質分離提供實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

實驗用材料為按陳宗禮［3］等方法培養(yǎng)25 d 狗頭棗組培苗。

1.2 方法

實驗設計:按三因素四水平設計實驗，分別設計纖維素酶(sigma)0.1 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L 四個濃度水平;果膠酶(sigma)0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 四個濃度水平;甘露醇0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 四個濃度水平;共16 個組合［4］。

原生質體分離:在超凈工作臺中，取培養(yǎng)好的狗頭棗試管苗葉片，剪取頂端完全展開的5 片葉子。稱重后，將葉片剪成1 ～2 mm 的細條狀放入經過濾滅菌后的混合酶液中，使材料和酶液的體積比為1∶10。在(25 ±2)℃、50 r/min 的搖床上、黑暗的條件下震蕩酶解。每隔2 h 取酶解液觀察并統(tǒng)計原生質體數量，直至原生質數量不在增加，確定最佳酶解時間。

原生質數量測定:使用血球計數板對原生質體產量進行統(tǒng)計

原生質體數(個/mL)= 5 個大格內總原生質體數×5 ×1 000 ×原生質體稀釋倍數。每個樣處理平均計數測定3 次以上，最后取其平均值。

原生質產量=原生質體數(個/mL)×稀釋后體積(mL)÷懸浮細胞總質量(g)

原生質體活力測定:FDA 熒光染色法。

原生質體活力 =(被染上色的原生質體數÷觀察到的原生質體總數)×100%

活原生質體產量=原生質體產量×原生質體活力

2 結果與分析

在狗頭棗葉片酶解過程中，從酶解開始的第2 h開始，每隔2 h 吸取酶解混合液并進行原生質體純化。將純化后的原生質體，在血球計數板上進行計數，計算其原生質體產量，直到原生質體的數目比前一次記錄的個數不再增加時，停止酶解。從實驗記錄的結果中，我們發(fā)現在狗頭棗葉片酶解過程進行到8 h，獲得的原生質體數目比較多，活原生質體數量也比較大，分離效果比較理想，統(tǒng)計結果見表1。

2.1 不同組合對狗頭棗葉片原生質分離的影響

在不同酶液濃度和甘露醇濃度組合中，F15 的組合纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.4 g/L、甘露醇0.6 mol/L 分離的效果最好，原生質體的產量達到2.12×106個/g，活原生質體數達到1.72 ×106個/g，成活率達到80.88%。其次為F16 纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.5 g/L、甘露醇0.5 mol/L，原生質體的產量為1.69 ×106個/g，活原生質體數達到1.03 ×106個/g，成活率達到61.121%。原生質體產量最低的組合為F14 纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.3 g/L、甘露醇0.7 mol/L，原生質體的產量為0.7 ×106個/g，活原生質體數達到0.53 ×106個/g。

2.2 酶液濃度對分離原生質體的影響

由統(tǒng)計結果表可知纖維素酶含量對狗頭棗葉片原生質分離的效果為k4＞k3＞k2＞k1。在纖維素酶含量分別為0.1 g/L、0.25 g/L、0. 5 g/L、1. 0 g/L時，原生質體產量的平均數分別為0.665 ×106個/g、1.187 5 × 106個/g、1. 22 × 106個/g、1.507 5 × 106個/g;活原生質產量的平均數分別為0.175 ×106個/g、0.22 ×106個/g、0.235 ×106個/g、0.75 ×106個/g。說明在狗頭棗葉片原生質體分離過程中需要纖維素酶的含量較多。當纖維素酶濃度為1.0 g/L 時，狗頭棗葉片原生質體的產量和活性都比較大。極差分析顯示纖維素酶對狗頭棗葉片原生質體分離的效果差值為0.765，對活原生質獲得的效果差值為0.43。

果膠酶含量對狗頭棗葉片原生質體分離的效果為k4＞k3＞k1＞k2。在果膠酶濃度分別為0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 時，原生體1.032 5 ×106個/g、0.775 ×106個/g、1.232 5 ×106個/g、1. 54 ×106個/g;活原生質產量的平均數分別為0.172 5 ×106個/g、0.15 ×106個/g、0.58 ×106個/g、0.415 ×106個/g。當果膠酶濃度為0.4 g/L，獲得的原生質體數量和活原生質體的產量較大。極差分析顯示果膠酶對狗頭棗葉片原生質體分離的效果差值為0.842 5，對活原生質獲得的效果差值為0.575。

2.3 滲透壓濃度對分離原生質體的影響

甘露醇濃度對狗頭棗葉片原生質體分離的效果為k2＞k1＞k4＞k3。在甘露醇濃度分別為0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 時，狗頭棗葉片原生質產量的平均數分別為1.16 ×106個/g、1.325×106個/g、0.99 ×106個/g、1.105 ×106個/g，或原生質體產量的平均數分別為0.455 ×106個/g、0.54 ×106個/g、0.235 ×106個/g、0.15 ×106個/g。當甘露醇濃度為0.6 mol/L 時，對狗頭棗葉片原生質體產量和活原生質體產量的影響較大。極差分析顯示甘露醇濃度對狗頭棗葉片原生質體分離的效果差值為0.335，對活原生質獲得的效果差值為0.39。

由以上結果可以看出，在用纖維素酶、果膠酶和甘露醇的混合液來分離狗頭棗葉片原生質體的過程中分離的主次因素分別為A 因素(纖維素酶)、B 因素(果膠酶)、C 因素(甘露醇)。由此得到原生質獲得量的組合為A4B4C2;獲得活原生質體獲得率的組合為A4B3C2。材料和酶液的比例為1∶10。酶解時間為8 h。本研究中的F15 原生質體的產量達到2.12 ×106個/g，活原生質體數達到1.72 ×106個/g，成活率達到80.88%，恰好是活原生質體獲得率的組合A4B3C2。所以我們認為適合狗頭棗葉片原生體分離的最佳組合為A4B3C2。

表1 不同酶液組合對原生質體分離的影響

3 討 論

原生質體是植物除去細胞壁后，具有活性的最小單位［5］，植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠。植物原生質分離的過程主要就是除去這兩種物質。分離中常用到的酶為纖維素酶和果膠酶，酶液通常需要保持較高的滲透壓［6］，以便使原生質體在分離前細胞處于質壁分離狀態(tài)，分離后不致膨脹破裂，常用的滲透壓穩(wěn)定劑為甘露醇等。本文的研究也采用了纖維素酶、果膠酶和甘露醇來完成。

我國從1974 年以來許多單位也相繼開展這方面的研究工作［7］。何業(yè)華［8］等用棗樹胚性懸浮培養(yǎng)細胞、細粒狀胚性愈傷組織、未細切愈傷組織和已細切愈傷組織4 種材料做了原生質體分離研究，發(fā)現用濃度為10 g/L 纖維素酶+1 g/L 離析酶+CPW鹽+0.7 mol/L 甘露醇組成的混合酶液對起始材料進行16 h 的酶解，可獲得較高的原生質體產量，且原生質體活力較高。劉曉光等［7］用冬棗花藥愈傷組織懸浮系做了原生質體分離研究發(fā)現用0.6 mol/L 甘露醇+0.1%MES+20 ～25 g/L 纖維素酶，酶解16 h得到的原生質體產量和活力較高。趙維峰［9］等研究了毛葉棗和冬棗愈傷組織的原生質體分離條件發(fā)現毛葉棗酶解所需酶液濃度為纖維素酶10 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L;冬棗酶解所需酶液濃度為纖維素酶15 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L，酶解時間均為14 ～16 h。邢東方［10］以繼代20 d 左右的灰棗試管苗頂梢3 片完全展開的嫩葉為分離材料在2.0% Cellulase R -10 +0.1%MacerozymeR-10 +0.1% Pectolase Y -23 +0.4 %Driselase 酶液中獲得了原生質體，產量為1.1 ×107個/g·FW，活性為85.7%，并發(fā)現4 種酶中，對原生質體分離影響大小順序為Driselase ＞CellulaseR -10 ＞MacerozymeR -10 ＞Pectolase Y -23，Driselase對原生質體的分離起首要作用。牛瑜菲［11］研究了酸棗花粉四分體時期原生質體分的酶液組合發(fā)現用蝸牛酶1.0% +纖維素酶0.5% +甘露醇0.3 mol/L+0.1% MES，酶解4 h 效果最佳，同時在酸棗葉片愈傷組織懸浮細胞系原生質體分離時的酶液濃度為纖維素酶10 g/L+離析酶5 g/L+甘露醇0.7 mol/L+0.1% MES，酶解時間16 h。趙維峰［12］用毛葉棗做研究，發(fā)現組培苗葉片分離出具有活性的原生質體能力優(yōu)于愈傷組織的懸浮系，其中毛葉棗所需酶液濃度為纖維素酶10 g/L +離析酶4 g/L +甘露醇0.7 mol/L;冬棗所需酶液濃度為纖維素酶15 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L。

本文的研究結果和上述研究存在一定差異的原因可能是所用的材料具有個體差異。本實驗只對狗頭棗組培苗葉片原生質體分離過程中纖維素酶、果膠酶、甘露醇濃度組合進行了探討。至于其它的組織或因素是否會對其原生質分離效果存在影響還需進一步的研究。

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