山綠茶有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝藥效研究

崔偉曦，楊 杰，陳筱清，毛 茜，聞曉東，王 強(qiáng)*

(1.中國(guó)藥科大學(xué) 中藥學(xué)院中藥分析教研室，江蘇 南京210009;2.首都醫(yī)科大學(xué) 中藥學(xué)院，北京100069)

山綠茶為冬青科冬青屬植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的干燥葉，主產(chǎn)于廣西、海南等地，全年可采，資源豐富，具有悠久的民間藥用歷史，多泡茶飲，具有清熱解毒，消腫止痛，活血通脈的功效，主要用于降血壓，降血脂，降膽固醇，冠心病，腦血管意外所致的偏癱等疾?。?］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，山綠茶對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)療效顯著，但其有效部位和活性成分尚不明確?；瘜W(xué)研究表明，山綠茶中富含酚酸和黃酮類成分［2-3］，故本文對(duì)山綠茶中總酚酸和總黃酮兩個(gè)有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝的藥效作用進(jìn)行了研究，以期對(duì)山綠茶資源的開發(fā)與有效利用及藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 植物來(lái)源

山綠茶采自廣西，由中國(guó)藥科大學(xué)王強(qiáng)教授鑒定為冬青科冬青屬植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的葉，標(biāo)本(No.20080201)存放于中國(guó)藥科大學(xué)中藥分析教研室。

1.2 主要試劑與儀器

甘油三酯(TG)試劑盒，總膽固醇(TC)試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)試劑盒，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒，血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;乙腈和甲酸購(gòu)自Merck 公司(色譜純，Merck，Darmstadt，Germany);其它試劑均為分析純。

紫外- 可見分光光度計(jì)(UV - 2501PC，Shimadzu);高效液相色譜儀(Agilent 1100 Series)、DAD檢測(cè)器、Agilent ChemStation 色譜工作站;色譜柱(Kromasil，4.6 ×150 mm);酶標(biāo)儀(Epoch，BioTek，USA);勻漿機(jī)(IKA，T10 basic Ultra - TURRAX，Germany)。

1.3 動(dòng)物及飼料

清潔級(jí)雄性SD 大鼠(120 ～150 g)，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(蘇)2000 -0002)。

高脂飼料配方 基礎(chǔ)飼料858 g/kg，豬油100 g/kg，膽固醇10 g/kg，膽酸鈉2 g/kg，蔗糖30 g/kg;普通飼料及高脂飼料均由江蘇省南京市青龍山動(dòng)物繁殖廠提供。

2 方 法

2.1 山綠茶總酚酸和總黃酮的制備

取山綠茶藥材5 kg，以80 %乙醇溶液浸泡過(guò)夜，加熱回流提取2 次，每次2 h。提取液減壓回收溶劑，濃縮得稠浸膏，以4 000 r·min-1離心10 min，分離得到上清液和沉淀部分。上清液經(jīng)HPD -400大孔樹脂吸附分離，先以水洗脫3 倍柱體積，棄去，再分別以10%、30%和50%乙醇洗脫，合并10%和30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮得浸膏，自然晾干，粉碎，過(guò)60 目篩，得到山綠茶總酚酸有效部位，得率1.62%;取50%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮得浸膏，自然晾干，粉碎，過(guò)60 目篩，得到山綠茶總黃酮有效部位，得率1.52%。實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定量總酚酸和總黃酮粉末用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸溶液用于給藥。

2.2 山綠茶總酚酸和總黃酮的測(cè)定

2.2.1 山綠茶總酚酸的測(cè)定

精確稱取總酚酸粉末約4 mg，置棕色量瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，用50%乙醇補(bǔ)足原重，過(guò)濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，置于25 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇至5 mL，再分別精密加入0.3%十二烷基硫酸鈉硫酸鈉溶液2 mL 和0.5%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵(1∶1)混合溶液1 mL，搖勻，暗處放置5 min，加0.1 moL/L 鹽酸溶液至25 mL，搖勻，暗處放置20 min，在729 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。以綠原酸為對(duì)照品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，計(jì)算總酚酸含量。

2.2.2 山綠茶總黃酮的測(cè)定

精密稱總黃酮粉末約10 mg，置錐形瓶中，加入20 mL 甲醇，稱重，超聲提取30 min，用甲醇補(bǔ)足原重，過(guò)濾，取續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至3 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉試液4 mL，在再加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，在500.5 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值。以蘆丁為對(duì)照品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，計(jì)算總黃酮含量。

2.3 總酚酸和總黃酮中主要成分含量測(cè)定

2.3.1 總酚酸中綠原酸的含量測(cè)定

取總酚酸粉末約2 mg，精密稱定，置1 mL 棕色量瓶中，精密加入甲醇0.8 mL，超聲處理30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。在下述色譜條件下，以綠原酸為對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行檢測(cè)定量。色譜條件:色譜柱:Kromasil C18 柱(4.6 mm×150 mm);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min。流動(dòng)相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表1;檢測(cè)波長(zhǎng):326 nm。

表1 總酚酸中綠原酸測(cè)定梯度洗脫程序

2.3.2 總黃酮中蘆丁和華中冬青黃酮-7 -O -β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測(cè)定

精密稱取總黃酮粉末約2 mg，置于1 mL 量瓶中，精密加入0.8 mL 甲醇，超聲30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。在下述色譜條件下，以蘆丁和華中冬青黃酮-7 -O -β -D -吡喃葡萄糖苷制備混合對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行檢測(cè)定量。色譜條件:色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min。流動(dòng)相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表2;檢測(cè)波長(zhǎng):256 nm、285 nm。

表2 總黃酮中蘆丁和華中冬青黃酮測(cè)定梯度洗脫程序

2.4 大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

34 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周之后，隨機(jī)分為正常組(n=11)和模型組(n=23)，正常組大鼠給以普通飼料，模型組大鼠給以高脂飼料。飼養(yǎng)室內(nèi)溫度控制在20 ±2 ℃，相對(duì)濕度60% ～70%，明暗各12 h，自由飲水、進(jìn)食。3 周后，隔夜禁食12 h，眼眶靜脈取血，分離血漿，測(cè)定各大鼠血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL -c)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。另外，隨機(jī)抽取各組5 只大鼠，脫頸椎處死，分離肝臟并稱重，計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/大鼠體重×100%)，并取肝臟相同部位用4%中性多聚甲醛固定，進(jìn)行肝臟病理學(xué)檢查。測(cè)定結(jié)果(表3)顯示，與正常組相比，模型組大鼠體重和肝指數(shù)均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血漿TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也較正常組明顯升高(P ＜0.01)，HDL-c 較正常組降低(P ＜0.01);H＆E 染色結(jié)果顯示(圖1A 和B)，正常組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列呈索狀，肝竇無(wú)擴(kuò)張充血，未見明顯的脂肪變性;模型組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，但部分肝細(xì)胞體積變大變圓、胞漿內(nèi)有許多小的脂肪空泡或融合成較大的脂滴，肝竇受壓變窄，出現(xiàn)明顯的脂肪變性，由此表明，NAFLD 模型建立成功。

2.5 給藥方法

造模成功后，模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(n=6)、酚酸給藥組(n=6)和黃酮給藥組(n =6)。以上3 組大鼠給以高脂飼料，正常組大鼠(n =6)給以普通飼料，所有大鼠均自由進(jìn)食和飲水。此外，酚酸給藥組灌胃給以105 mg/(kg·d)總黃酮-0.5%CMC-Na 混懸液，黃酮給藥組給以100 mg/(kg·d)總酚酸-0.5%CMC -Na 混懸液，即相當(dāng)于生藥量6.5 g/(kg·d);正常組和模型對(duì)照組給以10 mL/(kg·d)0.5%CMC-Na。給藥周期為2 周。

2.6 肝指數(shù)和血液指標(biāo)的檢測(cè)

給藥2 周后，大鼠隔夜禁食12 h，稱量體重，眼眶靜脈取血，分離血漿，并分離出肝臟，預(yù)冷生理鹽水洗凈，吸水紙吸干，稱取肝臟濕重，計(jì)算肝指數(shù)。

血漿TG、TC、LDL -c、HDL -c、ALT 和AST 的含量按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

2.7 肝臟中TG 和TC 的測(cè)定

剪取相同部位肝組織，用無(wú)水乙醇制成10%肝勻漿(肝組織重量∶無(wú)水乙醇體積=1∶9)。肝組織中TG 和TC 含量按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

2.8 肝臟病理學(xué)檢查

取相同部位肝組織，4%中性多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，制片(4μm 厚)，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，由病理專業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下閱片，觀察組織的病理學(xué)改變，并按照肝細(xì)胞脂肪變的程度進(jìn)行評(píng)分(計(jì)分:0，無(wú);計(jì)分:1，＜1/4;計(jì)分:2，1/4 ～1/2;計(jì)分:3，1/2 ～3/4;計(jì)分:4，＞3/4)［4-5］。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以± SEM 表示。P ＜0. 05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P ＜0.01 為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 山綠茶總酚酸和總酚酸及其主要成分的含量

紫外-可見分光光度法結(jié)果顯示，總酚酸的含量為78.33% ±0.29%，總黃酮的含量為75.32% ±0.35%。高效液相法結(jié)果顯示，山綠茶總酚酸中綠原酸的含量為3.70% ±0.12%;總黃酮中蘆丁的含量為1.27% ±0.05%，華中冬青黃酮-7 -O -β -D-吡喃葡萄糖苷的含量為1.78% ±0.03%。

3.2 各組大鼠體重、肝指數(shù)及血液指標(biāo)的變化

各組大鼠體重、肝指數(shù)及各血液指標(biāo)的結(jié)果見表3。喂食5 周后，模型組大鼠體重和肝指數(shù)均較正常組顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血漿TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也較正常組明顯升高(P ＜0.05 或P ＜0. 01)，HDL - c 較正常組降低(P ＜0.01)。與模型組相比，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠體重和肝重均有降低的趨勢(shì)，酚酸給藥組大鼠體重和肝重分別較模型組降低3.72%和9.57%，黃酮給藥組降低8.09%和12.57%，但未呈現(xiàn)顯著性差異(P ＞0.05);酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠肝指數(shù)分別較模型組降低6.44%和5.71%，且存在顯著性差異(P ＜0.05);血脂各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠血漿TG、TC 和LDL-c 分別較模型組降低41.58%和35.70%(P ＜0.05)、37.44%和33.60%(P ＜0.05)、43.09%(P＜0.05)和64.43%(P ＜0.01)，HDL -c 分別較模型組升高32.65%和22.45%(P ＜0.05);轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)結(jié)果顯示，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠血漿ALT 分別較模型組降低33. 20% (P ＜0. 01)和21.50%(P ＜0. 05)、AST 分 別 較 模 型 組 降 低27.75%(P ＜0.01)和14.30%(P ＜0.05)。由以上結(jié)果可以看出，總黃酮在降低NAFLD 大鼠體重和肝重方面略優(yōu)于總酚酸;而總酚酸在改善血脂和轉(zhuǎn)氨酶方面略優(yōu)于總黃酮，但差異并不顯著，提示山綠茶抗NAFLD 是通過(guò)多種成分共同作用實(shí)現(xiàn)的。

表3 各組大鼠體重、肝指數(shù)及各血液指標(biāo)的比較

3.3 各組大鼠肝組織中TG 和TC 的含量變化

各組大鼠肝脂質(zhì)TG、TC 含量見表4。與正常組相比，模型組大鼠10%肝組織勻漿中TG 和TC 含量均顯著升高(P ＜0.01)。酚酸給藥組大鼠肝勻漿中TG 含量較模型組降低5.72%，但兩組間不存在顯著性差異，TC 含量較模型組降低18.55%(P ＜0.01);黃酮給藥組大鼠肝勻漿中TG 和TC 含量分別較模型組降低20.71%和26.62%(P ＜0.01)，在降低NAFLD 大鼠肝脂質(zhì)含量方面略優(yōu)于酚酸組。

表4 各組大鼠肝臟中甘油三酯和膽固醇的含量

3.4 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下觀察各組大鼠肝組織HE 染色切片，結(jié)果如圖1 所示，3 周時(shí)正常組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列呈索狀，肝竇無(wú)擴(kuò)張充血，未見明顯的脂肪變性(圖1A);模型組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)尚可見，但部分肝細(xì)胞體積變大變圓、胞漿內(nèi)有許多小的脂肪空泡或融合成較大的脂滴，肝竇受壓變窄，出現(xiàn)明顯的脂肪變性(圖1B)。5 周時(shí)正常組大鼠肝組織形態(tài)基本與3 周時(shí)相同，未見異常病理變化(圖1C);模型組大鼠肝組織脂變程度較3 周時(shí)明顯加重，呈彌漫性脂肪變性(圖1D);酚酸給藥組大鼠(圖1E)和黃酮給藥組大鼠(圖1F)肝組織脂肪變性程度均明顯減輕，脂變積分如圖1G 所示，與模型組相比，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠肝組織脂變積分均顯著降低(分別為P ＜0. 05 和P ＜0.01)，黃酮的改善效果略優(yōu)于酚酸，但2 組的脂變積分之間不存在顯著性差異。

圖1 肝組織病理切片(HE 染色，×200)

4 結(jié) 論

山綠茶總黃酮在降低非酒精性脂肪肝大鼠體重、肝重，肝脂質(zhì)TG 和TC 含量以及改善肝臟組織形態(tài)和脂肪變性方面略優(yōu)于總酚酸;而總酚酸在改善血脂和轉(zhuǎn)氨酶方面略優(yōu)于總黃酮，但兩有效部位抗非酒精性脂肪肝藥效作用差異并不顯著，提示山綠茶抗非酒精性脂肪肝是通過(guò)多種成分共同作用實(shí)現(xiàn)的。

山綠茶為常綠植物，其葉四季均可采，資源豐富。目前山綠茶主要作為生產(chǎn)山綠茶降壓制劑的原料藥材，療效顯著，此外，藥理研究表明，山綠茶對(duì)于高血脂癥也具有較好的防治作用［6］，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，山綠茶總酚酸和總黃酮對(duì)非酒精性脂肪肝也有較好的治療作用。鑒于其較高的藥用價(jià)值及豐富的資源，山綠茶值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

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