荔枝草抗氧化部位的化學(xué)成分研究

龔 璽，楊守士

(上海一林生物科技有限公司，上海201202)

荔枝草為唇形科鼠尾草屬植物荔枝草(Salvia plebeia R. Br.)的全草，別名有蛤蟆草、雪見草、野豬菜、青蛙草、皺皮草等，為1 年或2 年生直立草本植物。生于山坡、路邊、荒地、河邊等地，主產(chǎn)于江蘇、浙江、安徽，全國大部均見分布，資源豐富。有利水消腫，清熱解毒等功效，主治感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、肺熱咳嗽、腎炎及泌尿系統(tǒng)感染等［1］。前期的化學(xué)工作表明，該化合物含有黃酮類化合物、二萜類化合物和三萜類化合物、苯丙素類化合物、甾體化合物及飽和和不飽和脂肪酸酯等［2-7］。藥理活性廣泛，包括抗氧化、鎮(zhèn)咳平喘、抗菌抗病毒、保護(hù)線粒體等。臨床上治療瘡癤、皰疹及皮膚瘙癢等方面藥效確切［2-4，8］。

前期研究中發(fā)現(xiàn)荔枝草的抗氧化、抑制線粒體脂質(zhì)過氧化物生成等活性與富含的黃酮等多酚類成分相關(guān)。本文中選擇抗氧化活性最強(qiáng)的乙酸乙酯部位［8］進(jìn)行化學(xué)成分研究，并進(jìn)一步考察總黃酮和主要黃酮類成分的抗氧化活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材

植物于2012 年5 月采自上海浦東郊區(qū)，經(jīng)鑒定為唇形科鼠尾草屬植物荔枝草(Salvia plebeia R.Br.)，標(biāo)本現(xiàn)存于上海一林生物科技有限公司標(biāo)本室。

1.2 試劑與儀器

Bruker DRX -600 型核磁共振儀，Agilent MSD-Trap-XCT 質(zhì)譜儀。中壓液相色譜儀(EZ Purifier，ODS，43 -60 μ，Pharmacia 公司)。DIAION HP-20 大孔吸附樹脂為日本三菱公司產(chǎn)品。Sephadex LH-20 為Pharmacia 公司產(chǎn)品。柱層析硅膠(100～200 目、200 ～300 目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)，所用試劑均為分析純。

1.3 提取與分離

荔枝草干燥全草(31 kg)粉碎后以80%乙醇回流提取3 次，每次2 h，提取液減壓濃縮成浸膏，加水稀釋后分別用石油醚、乙酸乙酯萃取，得到石油醚部位(120 g)，乙酸乙酯部位(474.5 g)和水部位。200 g 乙酸乙酯部位樣品與300 g 硅膠(100 ～200 目)拌樣，上硅膠柱(100 ～200 目)，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1 -5∶1 -2∶1 -0∶1)洗脫，得4 個流分(SF1-SF4)。流分SF1經(jīng)多次硅膠(200 ～300 目)柱層析，二氯甲烷∶甲醇(20∶0 -20∶1 -10∶1)洗脫，TLC 跟蹤，得化合物1(55 mg)，化合物2(60 mg)和化合物6(15 mg)。流分SF2經(jīng)硅膠柱粗分，用二氯甲烷∶甲醇(10∶1 ～5∶1)洗脫，TLC 跟蹤，組分相近的流分合并，得5 個細(xì)分的流分(SF2a～SF2e)。其中SF2b部分經(jīng)硅膠柱純化，得化合物7(14 mg)。SF2c和SF2d流分進(jìn)一步經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜(80%甲醇)反復(fù)純化，得化合物3(150 mg)和化合物4(100 mg)，均為淡黃色粉末。流分SF2e經(jīng)Sephadex LH -20 柱色譜(70%甲醇)處理后，進(jìn)一步經(jīng)中壓制備液相，以梯度甲醇溶液(30% ～45%)洗脫，得到化合物5(10 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 淡黃色粉末，HCl-Mg 反應(yīng)為陽性，Molish 反應(yīng)為陰性。1H -NMR (600 MHz，DMSO -d6):δ3.75(3H，s，6 -OCH3)，6.55(1H，s，H -3)，6.63(1H，s，H -8)，6. 87(1H，d，J =8. 4 Hz，H -5')，7.40(1H，brs，H -2')，7.41(1H，brs，H -6')，12.8(1H，s，5 -OH).13C -NMR(150 MHz，DMSOd6):δ163.8(C-2)，102.6(C -3)，182.0(C -4)，152.1(C-5)，131.3(C-6)，157.0(C-7)，94.3(C-8)，152. 7(C -9)，104. 2(C -10)，121. 7(C -1')，113.2 (C-2')，149.6(C-3')，145.7(C-4')，116.1(C-5')，118.7(C -6')，59.8(OCH3)。該化合物的1H-和13C-NMR 數(shù)據(jù)與化合物楔葉澤蘭素一致［5］，故化合物1 鑒定為楔葉澤蘭素(eupafolin)。

化合物2 淡黃色粉末，HCl-Mg 反應(yīng)為陽性，Molish 反應(yīng)為陰性。1H -NMR(600 MHz，DMSO -d6):δ3.70(3H，s，6 -OCH3)，6.59(1H，s，H -8)，6.77(1H，s，H-3)，6.90(1H，d，J =8.4 Hz，H -3'，5')，7.92(1H，d，J =8.4 Hz，H -2'，6')，12.9(1H，s，5 - OH).13C - NMR(150 MHz，DMSO - d6):δ 163.7(C-2)，102.4(C -3)，182.2(C -4)，152.4(C-5)，131.5(C -6)，157.3(C -7)，94.4(C -8)，152.6(C -9)，103.9(C -10)，121.1(C -1')，128.0(C -2'，6')，115. 6(C -3'，5')，161. 7(C -4')，59.2(OCH3).該化合物的1H -和13C -NMR 數(shù)據(jù)與化合物高車前素一致［6，7］，故化合物2 鑒定為高車前素(粗毛豚草素，hispidulin)。

化合物3 淡黃色粉末，HCl-Mg 反應(yīng)為陽性，Molish 反應(yīng)為陽性。ESI - MS m/z:461. 1［M -H］-，299.1［M - H - glc］-;1H - NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ3.11(3H，s，6 -OCH3)，6.14(1H，s，H-3)，6. 26(1H，d，J =8. 4 Hz，H -3'，5')，6. 33(1H，s，H-8)，7.26(1H，d，J =8.4 Hz，H -2'，6')，12.25(1H，brs，5 -OH)，4.43(1H，d，J =7.8 Hz，H-1″)，2.55 -3.08(6H，m，H -2″ -6″).13C -NMR(150 MHz，DMSO-d6):δ164.2(C -2)，102.6(C -3)，182.2(C -4)，152. 4(C -5)，132. 6(C -6)，156.4(C-7)，94.4(C-8)，152.0(C-9)，104.7(C-10)，121.1(C -1')，128.4(C -2'，6')，115.9(C-3'，5')，161.3(C-4')，60.2(OCH3)，100.3(C -1″)，73.2(C-2″)，77.2(C -3″)，69.6(C -4″)，76.7(C-5″)，60.6(C -6″). 該化合物的1H -和13C -NMR 數(shù)據(jù)與化合物高車前苷一致［4，7］，故化合物3鑒定為高車前苷(homoplantaginin)。

化合物4 淡黃色粉末，HCl-Mg 反應(yīng)為陽性，Molish 反應(yīng)為陽性。ESI - MS m/z:477. 1［M -H］-，315.1［M - H - glc］-;1H - NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ3.77(3H，s，6 -OCH3)，6.75(1H，s，H-3)，6.91(1H，d，J =8.4 Hz，H -5')，6.98(1H，s，H-8)，7.42(1H，m，H -2'，6')，13. 0(1H，s，5 -OH).13C -NMR(150 MHz，DMSO -d6):δ164.5(C-2)，102.7(C-3)，182.2(C -4)，152.1(C -5)，132.5(C-6)，156.4(C-7)，94.2(C-8)，152.5(C-9)，105.7(C -10)，121.4(C -1')，113.5(C -2')，145.8(C-3')，149.9(C -4')，115.9(C -5')，119.1(C-6')，60.3(OCH3)，100.2(C -1″)，73.2(C-2″)，77.2(C -3″)，69.5(C -4″)，76.7(C -5″)，60.6(C-6″).該化合物的1H -和13C -NMR 數(shù)據(jù)與化合物假荊芥屬苷一致［4，7］，故化合物4 鑒定為假荊芥屬苷(nepitrin)。

化合物5 淡黃色粉末，Molish 反應(yīng)為陽性，Molish 反應(yīng)為陽性。ESI - MS m/z:479. 2［M -H］-，317.1［M-H-glc］-;1H NMR(600 MHz，DMSO-d6):δ2.68(1H，m，H -3a)，3.30(1H，m，H -3b)，3.85(3H，s，6 -OCH3)，5.38(1H，m，H -2)，6.31(1H，s，H-8)，6.76 -6.77(2H，m，H-5'，6')，6.89(1H，brs，H -2').13C -NMR(150 MHz，DMSO-d6):δ78.7(C -2)，42.3(C -3)，197.9(C -4)，158.0(C-5)，130.1(C-6)，158.6(C-7)，94.3(C-8)，154. 4(C -9)，103. 2(C -10)，129. 3(C -1')，114.4(C-2')，145.2(C -3')，145.8(C -4')，115.3(C-5')，118.1(C -6')，60.3(OCH3)，101.8(C-1″)，73.1(C -2″)，77.2(C -3″)，69.5(C -4″)，76.5(C-5″)，60.6(C -6″)。該化合物的1H -和13C-NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道［9］比較，鑒定合物5為5，7，4' -三羥基-6 -甲氧基-二氫黃酮-7 -O-β - D - 葡萄糖苷(5，7，4' - trihydroxy -6 - methoxy - dihydroflavone - 7 - O - β - D - glucopyranose)。

化合物6 淡黃色粉末，mp 215 -218 ℃。1H -NMR(600 MHz，DMSO -d6):δ6.74(1H，d，J =7.8 Hz，H-5)，6.96 -7.01(2H，H-2，6)，6.16(1H，d，J=12.6 Hz，Hα)，7.41(1H，d，J =12.0 Hz，Hβ)，9.40 -9. 54(2H，- OH)，12. 10(COOH)，該1H -NMR 數(shù)據(jù)與已知化合物咖啡酸一致［10］，故化合物6鑒定為咖啡酸。

化合物7 黃色粉末，ESI -MS m/z:359.1［M-H］-;1H -NMR(400 MHz，DMSO -d6):δ2.85 -3.02(2H，m，H-7)，5.04(1H，q，J =8.0，4.0 Hz，H-8')，6.25(1H，d，J =16.0 Hz，H -8)，6.54(1H，dd，J=8. 0，1. 6 Hz，H -6')，6. 65(1H，d，J =8. 0 Hz，H-5')，6.69(1H，d，J =1.6 Hz，H -2')，6.78(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.02(1H，d，J =8.0 Hz，H-6)，7.07(1H，d，J =1.6 Hz，H -2')，7.48(1H，d，J=16.0 Hz，H -7)，8.76 -7.81(2H，br s，-OH×2)，9. 19(1H，br s，- OH)，9. 68(1H，br s，-OH)。13C -NMR(100 MHz，DMSO -d6):δ125.3(C-1)，114.9(C-2)，145.6(C -3)，148.6(C -4)，115.7(C-5)，121.6(C -6)，145.9(C -7)，113.2(C-8)，165.9(C -9)，127.3(C -1')，116.7(C -2')，144.9(C-3')，144.0(C -4')，115.4(C -5')，120.0(C -6')，36.1(C -7')，72.8(C -8')，170.8(COOH)。該化合物的1H -和13C -NMR 數(shù)據(jù)與化合物迷迭香酸一致［10］，故化合物7 鑒定為迷迭香酸(rosmarinic acid)。

化合物5 的結(jié)構(gòu)圖

3 抗氧化活性測試

3.1 DPPH 自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)［8］方法，將待測液配成20、50、100、200 μg/mL 的溶液，用移液槍取溶液1 mL，加入60%乙醇溶液2 mL，0.1 mmo1/L DPPH 溶液1 mL ，搖勻，黑暗處靜置30 min。用60%乙醇調(diào)零，測定517 nm 處的吸光度A 樣品。同時，測定樣品溶液1 mL與60%乙醇3 mL 混合液在517 nm 處的吸光度A 對照，再測定1 mL DPPH 溶液與3 mL 60%乙醇在517 nm 處的吸光度A 空白。

3.2 還原能力測定

按文獻(xiàn)［11］采用鐵氰化鉀還原法測定還原能力，將待測液配成0、100、300 μg/mL 的溶液，用移液槍取溶液1 mL，加入pH=6.6 的磷酸緩沖液2.5 mL 和1%鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合后置于50℃水浴中20 min，加入10%三氯乙酸溶液2. 5 mL，4 000 r/min 離心l0 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸餾水和0.1%氯化鐵2.5 mL，混勻，靜置10 min，在700 nm 處測定吸光度，用蒸餾水調(diào)零，Vc 作為對照。

表1 荔枝草提取物和單體化合物的抗氧化活性

3.3 結(jié)果與分析

由表1 可見，荔枝草總黃酮和主要單體化合物均有較好的抗氧化活性。其中化合物1 和4 清除DPPH 自由基活性最強(qiáng)，還原Fe3+能力也較強(qiáng)。但結(jié)構(gòu)類似的化合物2 和3 的抗氧化能力明顯弱于1和4，說明黃酮結(jié)構(gòu)中B 環(huán)上鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)對于發(fā)揮抗氧化能力至關(guān)重要?？傸S酮的抗氧化能力雖然強(qiáng)于乙酸乙酯部位，但無顯著優(yōu)勢，說明在制備總黃酮的過程中可能損失了一些含量較低但抗氧化活性顯著的組分?；衔? 和4 是含量最高的兩種成分，但其抗氧化活性并不顯著優(yōu)于乙酸乙酯部位，也說明乙酸乙酯部位可能含有某些抗氧化活性較強(qiáng)但含量較低的化合物。

本研究報道了野生荔枝草提取物及主要成分的抗氧化活性，提示該藥材可能含有含量不高但抗氧化活性顯著的組分，為該藥材的深入研究和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

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