高速逆流色譜分離制備梔子苷

錢 驊，趙伯濤 ，黃曉德，陳 斌，朱羽堯

(南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京210042)

梔子(Gardenia jusminoides)是衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，現(xiàn)代藥理研究表明，梔子具有解熱鎮(zhèn)靜、保肝利膽等功效，臨床上用于治療急性黃疸性肝炎［1］，其主要活性成分是梔子苷(京尼平苷，geniposide)和異梔子苷(gardenoside)等［2］。梔子苷在梔子果實(shí)中含量為3% ～8% ，而京尼平苷是梔子環(huán)烯醚醚苷中含量最高的一種，將其結(jié)構(gòu)修飾可得到療效較好的抗肝炎藥［3］，并且京尼平苷經(jīng)β 葡萄糖苷酶水解后再與氨基酸反應(yīng)可制備梔子藍(lán)色素［4-5］，這在日本已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)。有報(bào)道京尼平苷對(duì)植物有增產(chǎn)作用［6-8］，而水解后的京尼平可作生物膜交鏈劑，如利用京尼平交聯(lián)的明膠膜用于傷口包扎材料，利于傷口的愈合及減少炎癥的發(fā)生率等［9-10］。

梔子苷是一種水溶性較強(qiáng)的化合物，用水或乙醇等極性溶劑提取后，用大孔樹脂或硅膠分離純化，但硅膠吸附損失較多。高速逆流色譜(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同而進(jìn)行的色譜法，它沒有不可逆吸附;高回收率;進(jìn)樣量大，最大可達(dá)數(shù)克，且因固定相為液體，體系更換與平衡方便、快捷，目前是分離制備植物活性成分的一個(gè)重要手段［11-14］。本文在參考前人研究基礎(chǔ)上，對(duì)逆流色譜分離制備梔子苷的條件進(jìn)行研究。

1.1 儀器

HSCCC-TBE300A 高速逆流色譜儀(上海同田生化)，泵TBD-50A，TBD-2000UV Detector，TC-1050恒溫循環(huán)器，上海金達(dá)生化色譜工作站;Aglient 1200高效液相色譜儀(含G1322A Degasser，G1311A Quat pump，G 1316A TCC，G1315D DAD)，Agilent chemstation.UO3200HE;

1.2 材料與試劑

梔子果實(shí)為山梔子(Gardenia jusminoides El.)由江蘇省溧水博士牛生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供.

HPLC 分析用甲醇、乙腈為色譜純，其它溶劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為過濾純凈水。梔子苷對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的處理

梔子粉碎至0.30 mm 粒徑，用50%乙醇加熱回流提取3 次，每次30 min，合并提取液，減壓回收溶劑，得濃縮液，依次過大孔吸附樹脂D - 140 和HPD300A，收集HPD300A 的30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，真空干燥得梔子苷粗品(HPLC 檢測(cè)含量為50.75%)，備用。

1.3.2 兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備

溶劑系統(tǒng)參照文獻(xiàn)［11］，選擇HSCCC 溶劑體系為:(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3);(2)正丁醇∶水(1∶1)，按比例配制于分液漏斗中劇烈振蕩，并靜置過夜，體系分相平衡后分離出上下相，分別超聲脫氣30 min，備用。上相為固定相，下相為流動(dòng)相，并用流動(dòng)相溶解梔子苷粗品，濃度為25 mg/mL。

采用紫外分光光度法測(cè)定梔子苷在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。梔子苷在溶劑系統(tǒng)1 和2 中的分配系數(shù)分別為0.30 和0.39。

1.4 HSCCC 分離過程

恒溫循環(huán)器溫度控制在25℃。將上相以流速10 mL/min 泵入高速逆流色譜儀的螺旋管，待螺旋管完全充滿后(300 mL)，此時(shí)有固定相流出，先以850 r/min 的速度旋轉(zhuǎn)，然后以2 mL/min 泵入流動(dòng)相，經(jīng)過一段時(shí)間(約90 ～100 min)，當(dāng)體系達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡后，將樣品由進(jìn)樣閥注入分離管路，柱后流出物以紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長為254 nm，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分。進(jìn)樣4 h 后，停止主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，用壓縮空氣把固定相推出，測(cè)得溶劑系統(tǒng)(1)和(2)固定相保留率分別為54%和63%。

1.5 HPLC 分析

色譜條件 參照［15］，色譜柱:Eclipse XDB -C18(5 μm，4.6 mm ×150 mm):流動(dòng)相:水∶乙腈(85∶15)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長238 nm，25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，梔子苷標(biāo)樣用甲醇溶解，濃度0.17 μg/μL，0.45 μm 微孔濾膜濾過，所用溶劑均用有機(jī)膜濾過.梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線:y =1 152.2x +6.475，R2=0.999 7。

2 結(jié)果與分析

不同溶劑系統(tǒng)對(duì)梔子苷分離的影響。

圖1 梔子中梔子苷HSCCC 分離色譜圖和相應(yīng)峰的HPLC 圖溶劑體系:乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)

475 mg 梔子苷粗品(HPLC 測(cè)定含量為50.75)，用流動(dòng)相19 mL 完全溶解后，經(jīng)高速逆流色譜分離后顯示有兩個(gè)主要的峰，我們對(duì)出峰時(shí)間為80 ～105 min 的峰Ⅰ和105 ～126 min 峰Ⅱ進(jìn)行了收集，得到組分Ⅰ和Ⅱ160.0 mg，并對(duì)Ⅰ和ⅡHPLC 對(duì)照品外標(biāo)法定量測(cè)定，峰Ⅱ梔子苷含量為86.6%，峰Ⅰ梔子苷含量6.32%.Ⅱ經(jīng)高速逆流色譜工藝其目標(biāo)成分梔子苷回收率為81.36% 。

100 mg 梔子苷粗提物(HPLC 測(cè)定含量為50.75)，用流動(dòng)相15 mL 完全溶解后，經(jīng)高速逆流色譜分離后顯示有3 個(gè)主要的峰，我們對(duì)出峰時(shí)間為76 ～84 min 組分Ⅰ，84 ～120 minⅡ和120 ～160 minⅢ進(jìn)行了收集，Ⅰ組分梔子苷含量很低，得到Ⅱ17.04 mg(13.7%)和Ⅲ38.0 mg(92.8%)。

Ⅲ經(jīng)高速逆流色譜工藝其目標(biāo)成分梔子苷回收率74.88% 。

圖2 梔子中梔子苷HSCCC 分離色譜圖和相應(yīng)峰的HPLC 圖溶劑體系:正丁醇∶水(1∶1)

圖3 梔子中梔子苷HSCCC 分離色譜圖和相應(yīng)峰的HPLC 圖溶劑體系:正丁醇∶水(1∶1)

在分離體系不變情況下，未清洗柱子，即未用壓縮空氣推出固定相，以2 mL/min 泵入流動(dòng)相，經(jīng)過一段時(shí)間(約10 min)當(dāng)體系達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡后，500 mg(HPLC 67.7%)梔子苷粗品用20 mL 流動(dòng)相全溶解后，繼續(xù)進(jìn)樣。經(jīng)高速逆流色譜分離后顯示有兩個(gè)主要的峰，分別為峰Ⅰ78 ～120 min 和峰Ⅱ120 ～157 min，對(duì)組分Ⅰ和Ⅱ收集和HPLC 梔子苷含量測(cè)定，得到Ⅰ41.31mg(3.7%)，Ⅱ205.0 mg(91.8%)。Ⅱ經(jīng)高速逆流色譜工藝其目標(biāo)成分梔子苷回收率78.12%.這也說明HSCCC 分離體系相同，又分離物質(zhì)相同，則可連續(xù)進(jìn)樣，出峰時(shí)間也相同，均為120 min 后開始出峰，對(duì)分離樣品含量影響不大，而樣品回收率還略有增高。

綜上3 次HSCCC 分離梔子樣品結(jié)果見表1。

表1 不同溶劑系統(tǒng)中梔子苷HSCCC 分離效果

文獻(xiàn)［11］采用分析型高速逆流色譜測(cè)定分配系數(shù)K，如其測(cè)得溶劑系統(tǒng):(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3)的K 為0.44;(2)正丁醇∶水(1∶1)的K為0.94。本文采用紫外分光光度法測(cè)定溶劑系統(tǒng):乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)和正丁醇∶水(1∶1)的K 值分別為0.30 和0.39。本文溶劑系統(tǒng)(2)正丁醇∶水(1∶1)比溶劑系統(tǒng)(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)的洗脫時(shí)間延后，說明梔子苷在溶劑系統(tǒng)2 比溶劑系統(tǒng)1 的分配系數(shù)大，即梔子苷向上相(固定相)轉(zhuǎn)移的傾向，溶劑系統(tǒng)2 比1 要大。

文獻(xiàn)［11］分析型高速逆流色譜采用溶劑系統(tǒng):乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1∶3)時(shí)，其梔子苷出峰時(shí)間為80 ～100 min. ，固定相保留率為60%。而文獻(xiàn)制備型高速逆流色譜采用溶劑系統(tǒng):乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)，其出峰時(shí)間較晚，180 min.以后才開始出峰，固定相保留率70% 。本文比較了兩個(gè)溶劑系統(tǒng):(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)和(2)正丁醇∶水(1∶1)。雖然溶劑系統(tǒng)均為(1)，但本文出峰時(shí)間較文獻(xiàn)［11］報(bào)道180 min.早，為105 ～126 min，這是因?yàn)樵O(shè)備型號(hào)不同(文獻(xiàn)為TBE -1000A，本文為TBE300A)，螺旋管柱體積不同，而出峰時(shí)間不僅與螺旋管柱體積有關(guān)，還與流動(dòng)相流速，固定相保留因子，分配系數(shù)均有關(guān)。

由溶劑選擇軟件可知，溶劑系統(tǒng)(2)正丁醇∶水(1∶1)和溶劑系統(tǒng)(1)乙酸乙酯∶正丁醇∶水(2∶1.5∶3)的上下相密度差分別為0.1357 和0.108，而兩相的密度差越大，固定相保留率就高，且分相時(shí)間也短，這都有利用分離度的提高。梔子苷極性大，適合用溶劑系統(tǒng)2 和1 來分離。

只要選定的溶劑系統(tǒng)具有一定的固定相保留率和分離溶劑系統(tǒng)相同，柱子可以不經(jīng)清洗，經(jīng)短暫平衡后，可接著再進(jìn)樣分離，而對(duì)其所分離梔子苷純度和樣品回收率無影響，而這可大大節(jié)省時(shí)間和溶劑。

本文所分得的梔子苷最大含量為92.%，純度不是很高，這一方面是由于收集時(shí)是從HSCCC 峰的基部開始的，而非從含量較高的峰的肩部開始收集的;另一方面，可以通過HSCCC 的其它條件，如溫度、轉(zhuǎn)速和流速的比較，以獲得更高的含量。

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