吉西他濱聯(lián)合溶瘤型腺病毒治療大腸癌的體外研究

渠紅霞，袁彩君，王 越

在世界范圍內(nèi)，大腸癌在癌癥的病死率中排第4位，每年有100多萬的大腸癌新發(fā)病例[1]，國(guó)內(nèi)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。大腸癌的治療主要依靠手術(shù)，晚期治療主要以化療為主，但是療效不甚理想，為了尋求新的治療方法，全世界的研究學(xué)者把目光投向了溶瘤型腺病毒。溶瘤型腺病毒又稱選擇復(fù)制性腺病毒，其能夠在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制，但不能在正常細(xì)胞中復(fù)制，因具有可復(fù)制、體積小、彌散能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為腫瘤生物治療的熱點(diǎn)[2-3]。

目前研究較多的溶瘤型腺病毒是Barker和Berk研發(fā)的E1B缺失腺病毒ONYX-015。ONYX-015又稱dl1520,是敲除了編碼55 kDa蛋白的E1B區(qū)2496-3323核苷，且在E1B區(qū)的2022位點(diǎn)上C改變?yōu)門，使得dl1520感染的宿主細(xì)胞無法編碼55 kDa蛋白[4]。因其具有眾多優(yōu)點(diǎn)已進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)[5]，同時(shí)已有研究表明，dl1520在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)還可增加其療效。與dl1520相似，ZD55同樣是編碼E1B 55 kDa核酸缺失型溶瘤型腺病毒，但是ZD55可攜帶外源抗腫瘤基因，ZD55的優(yōu)點(diǎn)使得其被多數(shù)學(xué)者應(yīng)用于溶瘤型腺病毒攜帶外源抗腫瘤基因的分子治療。但是腺病毒的安全性部分是基于在人類正常細(xì)胞中復(fù)制缺陷的特性,而目前應(yīng)用的溶瘤型腺病毒來自野生腺病毒,有一定回復(fù)突變的危險(xiǎn)性[6]。因此鑒于腺病毒的特性，dl1520在治療腫瘤時(shí)可能存在安全隱患。

鹽酸吉西他濱(Gem)化學(xué)名為2′-脫氧-2′，2′-二氟胞苷鹽酸鹽(β-異構(gòu)體)，是美國(guó)禮來公司研發(fā)的核苷類抗代謝抗腫瘤藥物。有報(bào)道指出Gem與腺病毒聯(lián)合應(yīng)用時(shí)能獲得良好的腫瘤細(xì)胞殺傷效果，且對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制有一定的抑制作用[7-8]。本研究以體外培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞系HCT-116及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究模型，單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用Gem和E1B缺失溶瘤型腺病毒，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及安全性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料dl1520、ZD55和重組腺病毒(Ad-GFP)購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司，HCT-116和HUVEC購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，MTT購(gòu)自Biosharp公司，McCOY′s5A培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素(PS)及胎牛血清購(gòu)于天津永大化學(xué)試劑有限公司，Gem購(gòu)于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，5氟尿嘧啶(5-Fu)購(gòu)于南通海爾斯醫(yī)藥有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥品制備細(xì)胞均采用貼壁培養(yǎng)法，HCT-116在McCOY′s5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HUVEC在高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以上兩種培養(yǎng)基均含10%胎牛血清、雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml)。細(xì)胞置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3天)以0.25%胰酶消化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Gem或5-Fu用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成合適濃度母液，過濾除菌后分裝保存在4 ℃冰箱待用。

1.2.2病毒感染率的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HCT-116(1×105)與HUVEC(5×104),接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h細(xì)胞貼壁后，棄掉完全培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基稀釋Ad-GFP以感染復(fù)數(shù)(MOI)=0、1、10、100感染細(xì)胞，4 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，感染72 h后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白(GFP)細(xì)胞，同時(shí)在可見光下計(jì)數(shù)該視野內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算感染率。感染率=GFP陽性細(xì)胞數(shù)/該視野內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)。

1.2.3細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HCT-116和HUVEC分別以1×104cell/孔、5×103cell/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后吸去培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)分組加入病毒和(或)藥物。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)大組、8個(gè)小組：(1)單獨(dú)病毒組:dl1520組和ZD55組；(2)聯(lián)合組：dl1520聯(lián)合Gem組、ZD55聯(lián)合Gem組、dl1520聯(lián)合5-Fu組、ZD55聯(lián)合5-Fu組；(3)單藥組：Gem組和5-Fu組。前兩大組均以MOI=10的無血清培養(yǎng)基稀釋的相應(yīng)病毒100 μl/孔感染上述細(xì)胞，單藥組以無血清培養(yǎng)基饑餓4 h后，與前兩組一起更換為完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，在聯(lián)合治療組中，感染24 h后加入Gem或5-Fu，藥物濃度為10 μmol/L，在單藥治療組中細(xì)胞鋪板48 h后加入Gem或5-Fu，藥物濃度為10 μmol/L。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，四周孔及間隙加無菌PBS 100 μl保濕，于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，鋪板5 d后(即感染4 d后)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，加入MTT(5 mg/ml)10 μl/孔，37 ℃孵育4 h后小心吸棄孔內(nèi)上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl/孔，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm波長(zhǎng)吸光值，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD均值-空白對(duì)照組OD均值)/(細(xì)胞對(duì)照組OD均值-空白對(duì)照組OD均值)×100%。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HCT-116和HUVEC分別以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h細(xì)胞貼壁后，棄單藥組，按上述細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)分組感染病毒及加入藥物。鋪板5 d后(即感染4 d后)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.5病毒滴度檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞HCT-116和HUVEC分別以1×105cell/孔、5×104cell/孔，接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h細(xì)胞貼壁后，棄單藥組，按上述細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)分組感染病毒及加入藥物。鋪板5 d后(即感染4 d后)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，收集各組細(xì)胞，PBS洗3次，-80 ℃凍溶3次，離心，取上清液，用TCID50測(cè)定病毒滴度，Karbers公式計(jì)算病毒滴度。

2　結(jié)果

2.1病毒感染率測(cè)定MOI=100時(shí)，HCT-116和HUVEC對(duì)腺病毒的感染均較敏感，且細(xì)胞的感染率均達(dá)到90%以上(見圖1)。

2.2細(xì)胞存活率不同組HCT-116和HUVEC存活率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F=18.546,P=0.000,95%CI(68.318,88.285)；F=37.079,P=0.000,95%CI(81.618,92.737)，見表1〕。

表1不同組HCT-116和HUVEC細(xì)胞存活率比較(%)

Table1Comparison of HCT-116 and HUVEC cells survival rate in different groups

組別HCT-116HUVECdl1520組84.5293.99ZD55組84.2985.92dl1520聯(lián)合Gem組62.1081.20ZD55聯(lián)合Gem組65.1080.80dl1520聯(lián)合5-Fu組73.1083.70ZD55聯(lián)合5-Fu組72.1081.10Gem組90.1094.265-Fu組95.1096.45

注：HUVEC=人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)HCT-116和HUVEC dl1520聯(lián)合Gem組和5-Fu組均可部分殺傷細(xì)胞，ZD55聯(lián)合Gem組細(xì)胞殺傷效果略遜于dl1520聯(lián)合Gem組，dl1520組和ZD55組中只可少部分殺傷細(xì)胞(見圖2、3)。

2.4滴度檢測(cè)和病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn)MTT實(shí)驗(yàn)顯示，大腸癌細(xì)胞系HCT-116中dl1520聯(lián)合Gem組、ZD55聯(lián)合Gem組分別比dl1520組、ZD55組病毒滴度降低約400倍、50倍，dl1520聯(lián)合5-Fu組、ZD55聯(lián)合5-Fu組比dl1520組、ZD55組降低不明顯；正常細(xì)胞系HUVEC中病毒滴度降低不明顯(見圖4)。

圖4　TCID50檢測(cè)

圖1　MOI=100時(shí)細(xì)胞感染率

圖2　HCT-116細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)(光學(xué)顯微鏡，×400)

圖3　HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)(光學(xué)顯微鏡，×400)

3　討論

目前溶瘤型腺病毒治療腫瘤已成為當(dāng)今的熱點(diǎn)之一，許多臨床試驗(yàn)已證實(shí)溶瘤型腺病毒對(duì)多種惡性腫瘤都有一定的治療效果，包括顱腦腫瘤、頭頸部腫瘤、腹膜轉(zhuǎn)移腫瘤、結(jié)腸直腸腫瘤、胰腺腫瘤、肝臟腫瘤、骨肉瘤、腎臟腫瘤等[9-17]。而dl1520是溶瘤型腺病毒中研究最深入最廣泛的一種類型，是2型血清腺病毒與5型血清腺病毒的嵌合體，有許多學(xué)者認(rèn)為dl1520的選擇復(fù)制機(jī)制與P53的功能突變有關(guān)，但并不僅限如此[18]。腺病毒dl1520進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后病毒大量復(fù)制,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[19-20]。在腫瘤破裂時(shí)大量病毒被釋放，而當(dāng)病毒數(shù)量達(dá)到一定程度時(shí)就可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一些目前還未完全了解的危害或疾病，因此其在治療腫瘤方面可能存在很多安全隱患。

本研究就是針對(duì)腺病毒在治療大腸癌時(shí)在保證殺傷效果不受影響的前提下如何抑制病毒增殖所做的研究，通過在一定程度上抑制病毒復(fù)制來提高腺病毒治療大腸癌的安全性。在本實(shí)驗(yàn)中，各聯(lián)合組對(duì)大腸癌細(xì)胞系HCT-116的細(xì)胞殺傷作用雖然無差異，但是值得關(guān)注的是dl1520聯(lián)合Gem時(shí)病毒在大腸癌細(xì)胞系HCT-116內(nèi)病毒滴度比單獨(dú)應(yīng)用dl1520時(shí)降低約400倍，而dl1520聯(lián)合5-Fu時(shí)，沒有觀察到病毒滴度明顯降低，這就說明Gem與dl1520聯(lián)合應(yīng)用能使細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制減弱，而5-Fu則不能。雖然Gem與5-Fu相比單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用時(shí)在殺傷腫瘤細(xì)胞效果上無差異，而Gem與溶瘤型腺病毒的聯(lián)合應(yīng)用在治療大腸癌上的意義是毋庸置疑的，這就說明dl1520聯(lián)合Gem治療大腸癌是有意義的，而其中最引人注目的是二者的聯(lián)合應(yīng)用能抑制細(xì)胞內(nèi)病毒增殖，進(jìn)而提高了溶瘤型腺病毒在治療大腸癌的安全性。然而與dl1520相比，ZD55聯(lián)合Gem或5-Fu治療大腸癌細(xì)胞系HCT-116時(shí)，其病毒滴度無明顯降低。與ZD55相比dl1520是嵌合型腺病毒，而ZD55是由野生型腺病毒構(gòu)建而來，假設(shè)ZD55更加接近野生血清5型腺病毒，相對(duì)來講可能更加難以被抑制。

已有研究證實(shí)5-Fu、順鉑等藥物不能抑制病毒的復(fù)制[4]，但是5-Fu聯(lián)合溶瘤型腺病毒能夠有效提高治療大腸癌的療效。同時(shí)已有學(xué)者證實(shí)溶瘤型腺病毒突變體與Gem聯(lián)合應(yīng)用在一定程度上能夠抑制病毒復(fù)制，機(jī)制可能為病毒溶瘤早期細(xì)胞膜破裂后引起的化療藥物的滲透和(或)線粒體功能失調(diào)而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[20]，從而導(dǎo)致病毒不能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。也有學(xué)者認(rèn)為導(dǎo)入外源基因磷酸化Gem等核苷酸類似物、摻雜入DNA鏈或RNA鏈可阻止病毒在細(xì)胞中的大量復(fù)制。本研究結(jié)果與上述的觀點(diǎn)有相對(duì)一致性，認(rèn)為除了上述原因外，人類癌細(xì)胞的核苷酸激酶具有一部分催化Gem等核苷酸類似物的活性，從而抑制病毒增殖的作用，但是具體機(jī)制及改建后的溶瘤型腺病毒的復(fù)制因素仍需進(jìn)一步研究。

Gem聯(lián)合dl1520治療大腸癌比單獨(dú)應(yīng)用dl1520治療大腸癌有效，且在療效上與5-Fu的聯(lián)合無差異，但是與Gem的聯(lián)合能夠提高其安全性；而dl1520與5-Fu的聯(lián)合則不能提高其安全性，ZD55與Gem和5-Fu的聯(lián)合也說明了這點(diǎn)。本研究可能為將來大腸癌新的治療方法提供一定的依據(jù)，但是本實(shí)驗(yàn)尚有不足之處，現(xiàn)在僅處于基礎(chǔ)研究階段，而目前dl1520聯(lián)合Gem能夠降低病毒滴度的機(jī)制不十分清楚，可能與Gem是核苷酸類似物，進(jìn)而影響DNA合成有關(guān)，這還需要進(jìn)一步的研究。

1Tenesa A，Dunlop MG.New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies[J].Nat Rev Genet，2009，10(6):353-358.

2Kirn D,Martuza RL,Zwiebel J.Replication-selective virotherapy for cancer:biological principles,risk management and future directions[J].Nat Med,2001,7(7):781-787.

3Qian C,Liu XY,Prieto J.Therapy of cancer by cytokines mediated by gene therapy approach[J].Cell Res,2006,16(2):182-188.

4魏小雷,鄒曉平.E1B 缺失腺病毒在腫瘤治療中的進(jìn)展[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34(12):1274-1276.

5呂晨,錢程.溶瘤腺病毒聯(lián)合不同濃度阿霉素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào),2008，25(5)：559-563.

6Oualikene W,Gonin P,Eloit M.Lack of evidence of phenotypic complementation of E1A/E1B-deleted adenovirus type 5 upon superinfection by wild-type virus in the cotton rat[J].J Virol,1995,69(10):6518- 6524.

7萬銀波,張孝恒,宋宏銳.鹽酸吉西他濱合成研究[J].精細(xì)化工中間體,2011,41(2):38-41.

8Daniel S.Novel viral vector system for gene therapy[J].Viruses,2010,2(4):1002-1007.

9Andreansky S,Soroceanu L,Flotte ER,et al.Evaluation of genetically engineered herpes simplex viruses as oncolytic agents for human malignant brain tumors[J].Cancer Res,1997,57(8):1502-1509.

10Bossow S,Grossardt C,Temme A,et al.Armed and targetedmeasles virus for chemovirotherapy of pancreatic cancer[J].Cancer Gene Ther,2011,18(8):598-608.

11Li G,Kawashima H,Ogose A,et al.Efficient virotherapy for osteosarcoma by telomerase-specific oncolyticadenovirus[J].Cancer Res Clin Oncol,2011,137(6):1037-1051.

12Chen W,Wu Y,Liu W,et al.Enhanced antitumor efficacy of a novel fiber chimeric oncolytic adenovirus expressing p53 on hepatocellular carcinoma[J].Cancer Lett,2011,307(1):93-103.

13Wong RJ,Kim SH,Joe JK,et al.Effective treatment of head and neck squamous cell carcinoma by an oncolyticherpes simplex virus[J].Am Coll Surg,2001,193(1):12-21.

14Bennett JJ,Kooby DA,Delman K,et al.Antitumor efficacy of regional oncolytic viral therapy for peritoneally disseminated cancer[J].J Mol Med(Berl),2000,78(3):166-174.

15Kooby DA,Carew JF,Halterman MW,et al.Oncolytic viral therapy for human colorectal cancer and liver metastases using a multi-mutated herpes simplex virus type-1(G207)[J].FASEB J,1999,13(11):1325-1334.

16Wang H,Satoh M,Chen GP,et al.E1A,E1B double-restricted adenovirus enhances the cytotoxicity and antitumor activity of gemcitabine to renal cell carcinoma[J].Chin Med J,2011,124(7):1082-1087.

17陳英賽,陳嬌燕,王麗萍,等.重組人p53腺病毒注射液治療頸部腫瘤30例療效觀察[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，15(8)：881-882.

18Leitner S,Sweeney K,Oberq D,et al.Oncolytic adenoviral mutants with E1B19K gene deletions enhance gemcitabine-induced apoptosis in pancreatic carcinoma cells and anti-tumor efficacy in vivo[J].Clin Cancer Res，2009，15(5):1730-1740.

19諸琦，徐凱.溶瘤病毒與胰腺癌[J].外科理論與實(shí)踐,2007,12(3):295-297.

20Bischoff JR,Kirn DH,Williams A,et al.An adenovirusmutant that replicates selectively in p53-deficient human tumor cells[J].Science,1996,274(5286):373-376.