KLF6基因在原發(fā)性肝癌中遺傳不穩(wěn)定性的研究

王文香 田菊霞 關(guān)媛媛 于寧 徐錦屏

KLF6基因在原發(fā)性肝癌中遺傳不穩(wěn)定性的研究

王文香 田菊霞 關(guān)媛媛 于寧 徐錦屏

目的研究KLF6基因M1、M2、M4、D10S1716位點的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和雜合性缺失（LOH）與原發(fā)性肝癌進展的關(guān)系，為揭示抑癌基因作用機制和腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制提供實驗依據(jù)。方法從肝癌組織標本中抽提DNA，應(yīng)用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）法進行KLF6基因遺傳不穩(wěn)定性的研究。結(jié)果肝癌KLF6基因微衛(wèi)星位點LOH的檢出率為35.71%（10/28），與肝癌分化程度、有無包膜無相關(guān)性（均P＞0.05），但與臨床TNM分期密切相關(guān)（P＜0.01），LOH在肝癌Ⅲ～Ⅳ期檢出率為（75.00%，6/8）明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（20.00%，4/20）。MSI檢出率為17.86%（5/28），MSI與肝癌分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期和有無包膜均無相關(guān)性（均P＞0.05）。 結(jié)論 KLF6基因的遺傳不穩(wěn)定性可能是原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要機制，KLF6基因LOH的發(fā)生率與臨床TNM分期正相關(guān)。LOH在KLF6雜合性缺失的過程中起了重要作用，可作為肝癌惡化及進展的一個指標，MSI則可能影響腫瘤的預(yù)后。

肝細胞癌 KLF6基因 PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）法

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate genetic instability of KLF6 gene in hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsDNA was extracted from fresh tissue samples of 28 patients with hepatocellular carcinoma.Microsatellite instability (MSI)and loss of hererozygosity(LOH)of locus KLF6M1,KLF6 M2,KLF6 M4 and D10S1716 in KLF6 gene were examined by PCR-SSCP method.ResultsThe detection rate of LOH in KLF6 gene of HCC was 35.71%(10/28),which was correlated with TNM stages(P＜0.01), but not correlated with the differential degrees and tumor with or without capsule(P＞0.05).The detection rate of LOH in stageⅢ+Ⅳtumors was 75.00% (6/8),which was significantly higher than that in tumors of stageⅠ+Ⅱ (20.00%,4/20).The detection rate of MSI of KLF6 gene was 17.86%(5/28),which was not correlated with differential degrees,lymph node metastasis,TNM stages and with or without capsule(P＞0.05).ConclusionThe genetic instability of KLF6 gene may be associated with carcinogenesis and development of HCC.

原發(fā)性肝癌是病死率僅次于胃癌和食管癌的第三大常見惡性腫瘤，其中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌的90%。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)之一，其發(fā)病率約為30.3/10萬,每年約有14萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的50%以上[1-2]。Kruppel樣因子6（Kruppel-like factor 6，KLF6）是近年來發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，又稱ZF9/CPBP[3]，是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。研究顯示抑癌基因的遺傳不穩(wěn)定性是導致癌癥發(fā)生的一個重要因素，而國內(nèi)關(guān)于肝癌的遺傳不穩(wěn)定性鮮有報道。為了進一步研究KLF6基因在肝癌中的表達情況，本研究采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）法對28例肝癌病例進行 KLF6 M1、KLF6 M2、KLF6 M4和10p15區(qū)域D10S1716位點微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）和雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）的檢測，以探討KLF6基因在肝癌中失表達的機制[4-5]，分析KLF6遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集 收集2004-01—2007-10肝癌手術(shù)標本28例（由浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院病理科提供），每例標本中均包含腫瘤組織和癌旁組織，患者術(shù)前均未接受過放、化療。每例標本均分為兩份，一份直接于液氮中保存，另一份石蠟包埋備用。

1.1.2 引物序列 所有引物合成及試劑均購于上海生工生物工程公司。引物序列如下，D10S1716上游5′-AGC TGG ATT TGC TAC AGA CTT-3′，下游5′-GCC TTG AAG ACA TTT TGT GA-3′；KLF6 M1上游5′-GAG GGA GTG AGG CTT TCT GTT-3′，下游5′-TTT CCA GCC CAC TGT CTT CTT GAC-3′；KLF6 M2上游5′-ATG GCC CTG GTG ACT TCT TA-3′，下游5′-TAC TTG CGG AGC GTG AGC C-3′；KLF6 M4上游F:5'-GCA TTA AGA ATA GTG AAG GC-3′，下游5′-GAT GTG TTT GGC TCA GGG A-3′。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 將石蠟包埋組織行10μm切片，加入1 000μl二甲苯，38℃恒溫水浴，離心去上清液，循環(huán)2次；加入無水乙醇1 000μl，恒溫水浴，離心去上清液，循環(huán)2次，空氣中干燥；加入400μl消化緩沖液，6μl蛋白酶K溶液，恒溫水浴至組織完全呈絮狀；加入400μl苯酚-氯仿，震蕩混勻，離心，吸取上層水相至新管，重復(fù)抽提1次；加入800μl-20℃預(yù)冷無水乙醇，1/10體積3M醋酸鈉溶液，翻轉(zhuǎn)混勻，置于-20℃過夜。4℃離心，析出DNA沉淀；加入100μl 1×TE溶解DNA沉淀，-20℃冷藏備用。

1.2.2 PCR擴增 反應(yīng)總體積為25μl，包括 1.5μl 25mmol/L MgCl2、2.5μl 10×緩沖液、0.5μl 10mM dNTP、1 U Taq DNA聚合酶、引物各25 pmol/L；94℃變性10min，進入循環(huán)94℃30s、退火55～60℃30s、72℃45s，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳、溴乙錠染色,經(jīng)紫外燈下觀察，證實PCR擴增成功。

1.2.3 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染觀察 4μl PCR擴增產(chǎn)物與等體積變性上樣緩沖液（含98%去離子甲酰胺）混合，98℃變性10min，冰驟冷15s后，加樣于含8mol/L尿素的8%變性聚丙烯酰胺凝膠，140V電泳2h。凝膠經(jīng)10%乙醇恒溫搖床5min，1%HNO3搖床5min，0.1%硝酸銀溶液15min，每步結(jié)束后均以雙蒸水漂洗5min，最后0.28mol/L碳酸鈉顯色至條帶清晰，10%冰乙酸終止，玻璃紙封膠，風干保存。

1.2.4 遺傳不穩(wěn)定性判斷標準 PCR-SSCP電泳凝膠圖中，相應(yīng)等位基因位點只出現(xiàn)一條主帶，代表一個等位基因片段，為純合子；如出現(xiàn)兩條主帶則為雜合子，可用于LOH分析。腫瘤組織較正常組織相應(yīng)等位基因條帶減少或密度降低50%以上，為LOH；腫瘤組織較正常組織等位基因條帶增多或移位，為MSI。4個位點中只要1個位點發(fā)生MSI，則判斷為KLF6基因MSI陽性，LOH同上。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 組織電泳圖 腫瘤組織和癌旁組織KLF6 M1、KLF6 M2、KLF6 M4和D10S1716位點微衛(wèi)星片段均擴增成功，見圖1（圖中1、2、3、4為患者編號）。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其等位基因均為雜合子。與正常組織相比較，MSI表現(xiàn)為腫瘤組織等位基因條帶增加；LOH則是腫瘤組織等位基因條帶減少，見圖2（圖中26、27、43、48為患者編號）。

圖1 D10S1716位點PCR產(chǎn)物電泳圖（C:腫瘤組織；N:癌旁組織）

圖2 LOH和MSI的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖[腫瘤組織43C與癌旁組織43N條帶無異常；腫瘤組織48C較癌旁組織48N少2條基因條帶，為LOH陽性（箭頭所示）；腫瘤組織26C與癌旁組織26N條帶無異常；腫瘤組織27C較癌旁組織27N多1條等位基因條帶，為MSI陽性（箭頭所示）]

2.2 肝癌KLF6基因遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果表明，肝癌KLF6基因MSI檢出率為17.86%，與肝癌的分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、有無包膜和臨床TNM分期均無相關(guān)性（均P＞0.05）。LOH檢出率為35.71%，與臨床TNM分期密切相關(guān)（P＜0.01），在TNMⅢ～Ⅳ期中LOH的檢出率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（75.00%vs 20.00%），有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）；LOH在低分化組檢出率高于高分化組（38.46%vs 0%），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（66.67%vs 27.27%），但LOH與分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移和有無包膜均無相關(guān)性（均P＞0.05），見表1。

表1 肝癌KLF6基因遺傳不穩(wěn)定性與臨床病理特征之間的關(guān)系[例（%）]

3 討論

DNA復(fù)制過程中，微衛(wèi)星的“鏈滑”導致序列長度的改變，與正常細胞不同，在腫瘤細胞中這種“鏈滑”不能被錯配系統(tǒng)所修復(fù)，從而導致MSI的發(fā)生[6]。LOH指腫瘤染色體上的一對等位基因的DNA多態(tài)性基因座中的一個發(fā)生缺失，失去原本的雜合性。抑癌基因變異最常見的分子機制是其2個位點相繼因點突變和LOH而導致功能完全喪失，即廣為接受的Knudsen“兩次打擊理論”[7]。KLF6是一種在哺乳動物組織中普遍表達的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其編碼的蛋白含283個氨基酸，包括N-端轉(zhuǎn)錄活性功能域（201個氨基酸）和C-端鋅指結(jié)構(gòu)域（82個氨基酸）。鋅指結(jié)構(gòu)域能特異性結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的GC盒、CACCC盒等核心元件，直接作用于DNA，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。對于檢測基因MSI和LOH的方法，目前普遍運用的方法是選用較多的位點和選用多態(tài)性較小的單一位點進行研究。本研究選取肝癌KLF6特異性位點KLF6 M1、KLF6 M2、KLF6 M4和D10S1716多個位點法，分析肝癌中KLF6的遺傳不穩(wěn)定性及蛋白表達。

Naoki等[8]在研究腦腫瘤、肺腫瘤和一些癌細胞株的多態(tài)性錯義突變時發(fā)現(xiàn)，這些突變有導致KLF6中p21基因啟動子活性的降低和促進腫瘤細胞生長的作用，KLF6基因的突變可能導致KLF6蛋白合成障礙從而引發(fā)腫瘤。本研究中肝癌KLF6基因微衛(wèi)星位點LOH的檢出率為35.71%，與肝癌分化程度、有無包膜無相關(guān)性，但與臨床TNM分期密切相關(guān)，在肝癌Ⅲ～Ⅳ期檢出率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。而在癌旁組織未發(fā)現(xiàn)KLF6基因變異，可以說明該論點。Teixeira等[9]在頭頸鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，KLF6基因LOH發(fā)生率與腫瘤進展、復(fù)發(fā)和低生存率成正相關(guān)。Boyault等[10]檢測了肝癌患者KLF6的第二外顯子區(qū)域，沒有發(fā)現(xiàn)點突變，僅有6.8%的病例出現(xiàn)等位基因缺失。本研究說明肝癌KLF6基因LOH與臨床TNM分期密切相關(guān)，提示KLF6基因位點的LOH多發(fā)生于肝癌晚期；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的發(fā)生率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示KLF6基因位點的LOH可能有促進淋巴轉(zhuǎn)移的作用。

Berney等[11]在遺傳性非息肉病性結(jié)腸癌中首先報道過MSI，隨后在各種散發(fā)性腫瘤如胃癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌中均發(fā)現(xiàn)MSI現(xiàn)象。也有研究曾報道胃癌、結(jié)腸癌中nm23H1基因D17S396位點的MSI發(fā)生率在預(yù)后良好的臨床TNMⅠ+Ⅱ期明顯高于預(yù)后差的Ⅲ+Ⅳ期[12]，并推斷MSI是胃癌和結(jié)腸癌的早期分子標志，可作為早期診斷的指標。在本研究中，MSI檢出率為17.86%，但MSI與肝癌分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期和有無包膜統(tǒng)計學上無相關(guān)性。雖然臨床TNMⅠ～Ⅱ期的MSI發(fā)生率高于TNMⅢ～Ⅳ期，但無統(tǒng)計學差異，與上述研究報道有差異，可能與基因功能及調(diào)控的不同有關(guān)，需進一步深入研究。

本研究顯示KLF6微衛(wèi)星位點遺傳不穩(wěn)定性與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，隨著腫瘤的進展，LOH發(fā)生率提高，MSI發(fā)生率則隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及浸潤深度有下降的趨勢。KLF6基因的遺傳不穩(wěn)定性可能是導致抑癌基因突變，原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要機制。LOH在KLF6雜合性缺失的過程中起了重要作用，可作為肝癌惡化及進展的一個指標，MSI則可能影響腫瘤的預(yù)后，但因本研究所選樣本量偏小，有待以后的研究中進一步證實。

[1] 葉家才,崔書中,巴明臣.原發(fā)性肝癌的流行病學特征及其危險因素[J].實用醫(yī)學雜志,2008,24(10):1839-1841.

[2] Santaguida M,Schepers K,Passegué E,et al.JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal[J]. Cancer Cell,2009,15(4):341-352.

[3] Narla G,Heath K E,Reeves H L,et al.A candidate tumor suppressor genemutated in prostate cancer[J].Science,2001,294(5551):2563-2566.

[4] Szremska A P,Kenner L,Wagner E F,et al.JunB inhibits proliferation and transformation in B-lymphoid cells[J].Blood,2003, 102(12):4159-4165.

[5]王高雄,李新豐,孫旭日,等.耐藥相關(guān)蛋白P-gp、GST-π、TopoⅡ在原發(fā)性肝癌中的表達及其臨床意義[J].中華消化外科雜志,2007, 6(1):44-47.

[6] Loeb L A.Microsatellite instability induced by hydrogen peroxide in Escherichia coli[J].Mutat Res,2000,447(2):187-198.

[7] Knudson A J.Mutation and cancer：statisticalstudy of retinoblastoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,1971,68(4):820-823.

[8] Naoki K,Dong Y,Alexy C,et al.Mutational analysis of KLF6 gene in cancer,and mutated KLF6 gene affects on the cell proliferation in brain tumor[J].Proc Amer Assoc Cancer Res,2006,47 (5):357-362.

[9] Teixeira M S,O Camacho-Vanegas.KLF6 allelic loss is associated with tumor recurrence and markedly decreased survival in head and neck squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer,2007, 121(9):1976-1983.

[10] Boyault S,Hérault A,Balabaud C,et al.Absence of KLF6 gene mutation in 71 hepatocellular carcinomas[J].Hepatology,2005, 41(3):681-692.

[11] Berney,Fisher.Genomic alterations(LOH,MI)on chromosome 17q21-23 and prognosis of sporadic colorectal cancer[J].Int J Cancer,2000,89(1):1-7.

[12] Frydenberg J,Pertoldi C,Dahlgaard J,et al.Genetic variation in original and colonizing Drosophila buzzatii populationsanalysed by microsatellite loci isolated with a new PCR screening method [J].Mol Ecol,2002,11（2）:181-190.

Microsatellite instability and loss of heterozygosity in KLF6 gene of hepatocellular carcinoma

Hepatocellular carcinoma(HCC)KLF6 gene PCR-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)

2013-01-21）

（本文編輯：胥昀）

杭州市科技發(fā)展計劃項目（20091233Q30）

311201 杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院感染科（王文香），病理科（徐錦屏）；杭州師范大學基礎(chǔ)醫(yī)學部解剖學教研室（田菊霞、關(guān)媛媛、于寧）

田菊霞，E-mail：hztctjx@163.com