青蝦咽側(cè)體抑制激素基因全長cDNA序列的克隆及表達(dá)分析

卜憲飛李真真喬 慧傅洪拓,吳 滟龔永生蔣速飛熊貽偉

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

青蝦咽側(cè)體抑制激素基因全長cDNA序列的克隆及表達(dá)分析

卜憲飛1李真真2喬 慧2傅洪拓1,2吳 滟2龔永生2蔣速飛2熊貽偉2

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院, 無錫 214081; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 無錫 214081)

咽側(cè)體抑制激素(Allatostatin, AST)是一類由幾至幾十個(gè)氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)肽類激素, 在甲殼動物中刺激下頜器官合成甲基法尼酯, 影響甲殼動物的蛻皮和生殖。然而AST基因在甲殼動物中的克隆和表達(dá)卻罕見報(bào)道。研究克隆了青蝦的AST基因全長cDNA序列, 在甲殼動物中使用熒光定量PCR技術(shù)檢測了AST基因在不同組織中的表達(dá)。青蝦AST基因cDNA全長2995 bp, 包括242 bp的5′非編碼區(qū)(UTR), 647 bp的3′UTR, 2106 bp的開放閱讀框(ORF)。開放閱讀框編碼701個(gè)氨基酸, 可轉(zhuǎn)錄翻譯出35個(gè)AST多肽, 在C末端都具有相同的 Y/FXFGL-amide結(jié)構(gòu), 屬于A型-AST。氨基酸序列比對顯示保守氨基酸為Tyr、Ala、Phe、Gly、Leu。蛋白相似度比對顯示, AST多肽在無脊椎動物的進(jìn)化中是相對保守的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, 青蝦AST多肽與羅氏沼蝦聚在一起, 具有最近的親緣關(guān)系。熒光定量PCR檢測顯示, AST基因在所有被檢測組織中均有表達(dá), 由高到低依次為: 肝胰臟>腸道>精巢>腦>心臟>卵巢。對青蝦AST基因全長cDNA序列克隆和表達(dá)的研究為更進(jìn)一步的了解AST多肽在青蝦中的重要功能奠定了基礎(chǔ)。

青蝦; 咽側(cè)體抑制激素; 基因克隆; 基因表達(dá)

咽側(cè)體抑制激素(Allatostatin, AST)是一類由幾至幾十個(gè)氨基酸構(gòu)成的神經(jīng)肽, 由腦神經(jīng)細(xì)胞分泌的AST多肽前體水解而來。AST多肽首先在昆蟲中被發(fā)現(xiàn), 迄今已在昆蟲中分離純化出70多種。AST多肽通過神經(jīng)或體液途徑到達(dá)咽側(cè)體(Corpora allata, CA), 抑制咽側(cè)體的活性, 調(diào)節(jié)咽側(cè)體對保幼激素(Juvenile hormone, JH)的合成與釋放, 是參與昆蟲蛻皮和生長發(fā)育過程的一類重要激素[1]。除此以外, AST多肽還具有抑制腸道肌肉收縮[2,3]、抑制心臟搏動和輸卵管蠕動[4], 并能通過抑制卵黃蛋白原的合成與釋放從而抑制卵的形成等多種功能[5,6]。在AST多肽分離鑒定的基礎(chǔ)上, 許多編碼AST的基因也已經(jīng)被克隆。在Donly第一次鑒定了折翅蠊的AST基因全長cDNA序列[7]之后, 直翅目(Orthopteran)[8—10]、雙翅目(Dipteran)[3,11]、鱗翅目(Lepidoteran)[12,13—16]、網(wǎng)翅目(Dictyopteran)[17,18]中某些昆蟲的AST基因全長cDNA序列也相繼被確定。

除昆蟲以外, AST多肽也廣泛存在于甲殼動物(Crustecean)、腔腸動物(Coelenterate)以及軟體動物(Mollusk)中。在甲殼動物中, 斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、利莫斯螯蝦(Orcanectes limosus)和三葉真蟹(Carcinus maenas)中都分離提取到多種AST多肽[19]。神經(jīng)生理學(xué)研究表明, AST多肽在甲殼類動物體內(nèi)分布廣泛, 除了參與神經(jīng)、肌肉收縮節(jié)律以及神經(jīng)肌肉接頭興奮電位調(diào)節(jié)之外, 還參與刺激下頜器官(Mandibular organs, MO)甲基法尼酯(Methyl farne-soate, MF)的生物合成, 從而促進(jìn)蛻皮以及性腺的成熟[20—24]。然而目前有關(guān)甲殼動物AST基因的研究卻很少有相關(guān)報(bào)道, 僅見羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、克氏螯蝦(Procambarus clarkii)和大海蝦(Panulirus interruptus)AST基因全長cDNA序列的克隆。同屬無脊椎動物的甲殼動物與昆蟲同源性較高, 都具有周期性蛻皮等生命規(guī)律, 因此在甲殼動物中開展AST基因的研究對于甲殼動物生長發(fā)育機(jī)制的研究具有十分重要的意義。

青蝦(學(xué)名日本沼蝦, Macrobrachium nipponense)是我國淡水養(yǎng)殖蝦蟹類的重要品種, 然而隨著累代養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大, 青蝦養(yǎng)殖過程中普遍出現(xiàn)性早熟等品種退化現(xiàn)象。因此, 開展青蝦蛻皮及生殖發(fā)育相關(guān)功能和機(jī)制的研究, 對實(shí)現(xiàn)青蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展, 培育高產(chǎn)高效、品質(zhì)優(yōu)良的養(yǎng)殖品種十分必要。本研究擬采用分段克隆法克隆了青蝦AST基因全長cDNA序列, 并對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析探討,采用熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測了該基因在青蝦體內(nèi)的表達(dá), 以期為青蝦蛻皮及生殖發(fā)育相關(guān)基因的克隆研究奠定基礎(chǔ)。 qRT-PCR技術(shù)應(yīng)用于甲殼動物AST基因的研究, 可為甲殼類蛻皮及生殖發(fā)育相關(guān)研究提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)蝦 實(shí)驗(yàn)青蝦為野生青蝦, 采自太湖無錫湖區(qū), 暫養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室一周, 24h充氧, 養(yǎng)殖溫度維持在26—28℃, 日換水量約為1/2, 每天投喂2次。用于即時(shí)RNA提取。

儀器和試劑 RNAiso Plus、cDNA第一鏈合成試劑盒、3′-Full RACE Kit、5′-Full RACE Kit購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa); iScript cDNA Synthesis Kit、SsoFast EvaGreen Supermix購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司(BIO-RAD); RNeasy Mini Kit購自QIAGEN; UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒和引物合成等其他試劑均購自上海生工生物工程有限公司(Sangon)。冷凍離心機(jī)(貝克曼庫爾特Microfuge 22R); 凝膠成像系統(tǒng)(法國Vilber Chemismart系列); 紫外分光光度計(jì)(艾本德 BioPhotometer); PCR儀(艾本德 Autherized Thermal Cycler);熒光定量PCR儀(伯樂 BIO-RAD iQ5)。

1.2 方法

總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 取青蝦腦、腸道、肝胰臟、心臟、精巢、卵巢6種組織, 按照RNAiso Plus的操作步驟, 研磨、裂解組織后用傳統(tǒng)的酚仿抽提法提取總RNA。提取的各組織總RNA均使用RNA-freeDNaseⅠ純化, 純化后的RNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測其質(zhì)量及濃度, 按照TaKaRa cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn), ?20℃保存, 用于AST基因全長cDNA序列的克隆。用于熒光定量表達(dá)的cDNA由BIO-RAD的iScript cDNA Synthesis Kit合成, ?20℃保存。

引物設(shè)計(jì) 由于已知甲殼類AST基因全長cDNA序列長度都在3000 bp左右, 因此本研究采用分段克隆的方法, 根據(jù)大海蝦(Panulirus interruptus)、克氏螯蝦(Procambarus clarkii)、羅氏沼蝦(M. rosenbergii)的氨基酸序列及羅氏沼蝦的AST 基因全長cDNA序列的比對結(jié)果挑選4段保守序列, 針對這4段保守序列分別設(shè)計(jì)4組引物(每組2—3對),保證目的片段中相鄰的兩段上有20個(gè)左右的重疊序列, 克隆得到中間序列。

青蝦AST基因全長cDNA序列的獲得 采用分段克隆方法獲得了青蝦AST基因全長cDNA序列。

以青蝦腦組織cDNA為模板, 用4組引物克隆出了青蝦AST基因的中間序列(表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 反應(yīng)條件為: 94℃ 2min; 94℃ 30s; 56℃30s; 72℃ 30s; 35個(gè)循環(huán), 72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 回收后與pMD18-T載體連接, 并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)中。挑取陽性克隆菌落送往上海生工生物公司測序, 將所得AST基因cDNA中間序列于NCBI中進(jìn)行Blastx同源性分析。

根據(jù)已獲得的青蝦AST基因cDNA中間序列設(shè)計(jì)3′ RACE引物3ASF1和3ASF2以及5′ RACE引物5ASR1和5ASR2(表1)。根據(jù)3′-Full RACE、5′-Full RACE試劑盒操作步驟, 分別擴(kuò)增AST基因cDNA的3′端和5′端序列。反應(yīng)循環(huán)數(shù)為25, 其他條件如前。PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收后, 與pMD18-T載體連接, 并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)中。挑取陽性克隆菌落送往上海生工生物公司測序, 將所得AST基因cDNA 3′端和5′端序列于NCBI中進(jìn)行Blastx同源性分析。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences

序列分析 采用ContigExpress軟件將中間序列、3′端序列、5′端序列拼接得到AST基因全長cDNA序列。

在NCBI中對AST基因全長cDNA序列BLAST比對并做同源性分析; 用DNAStar軟件尋找開放閱讀框并翻譯出相應(yīng)的氨基酸序列; 使用SMART在線軟件分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能; 用ClustalX軟件及DNAStar軟件包中的MegAlign軟件對蛋白序列作比對及同源性分析; 采用MAGE4.0軟件以鄰接法(Neighbour-Joining)根據(jù)不同物種的AST氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qR T-PCR)的相對表達(dá)分析 取青蝦精巢、卵巢、心臟、肝胰臟、腦、腸道6種組織的RNA, 用BIO-RAD的iScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA。根據(jù)獲得的AST基因全長cDNA序列設(shè)計(jì)一對熒光定量特異引物QASF1和QASR1(表1); 根據(jù)羅氏沼蝦β-actin基因全長cDNA序列設(shè)計(jì)一對內(nèi)參引物Actin F和Actin R(表1)。qRT-PCR反應(yīng)體系為25 μL: 上下游引物各0.5 μL, Super Mix 10 μL, ddH2O 13 μL, 模板cDNA 1 μL (總量為50 ng)。反應(yīng)條件按照BIO-RAD SsoFast EvaGreen Supermix推薦條件: 95℃ 30s; 95℃ 5s; 60℃ 10s; 35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在BIO-RAD iQ5中進(jìn)行,每種組織cDNA樣品做3個(gè)重復(fù), 并作3個(gè)不加cDNA模板的陰性對照重復(fù)。內(nèi)參基因β-actin基因同樣每種組織cDNA樣品做3個(gè)重復(fù), 并作3個(gè)不加cDNA模板的陰性對照重復(fù), 反應(yīng)條件同上。

用BIO-RAD iQ5自帶實(shí)時(shí)分析軟件進(jìn)行溶解曲線分析, 用2?ΔΔCt法[25,26]計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量并作圖; 使用SPSS13.0軟件進(jìn)行顯著性分析; 用Turkey法進(jìn)行多重比較分析(P<0.05為顯著水平)。

2 結(jié)果

2.1 青蝦AST基因全長cDNA序列的克隆和分析

以青蝦腦組織cDNA為模板, 采用分段克隆方法和3′ RACE、5′ RACE法對AST基因全長cDNA序列進(jìn)行克隆, 得到全部中間序列和3′末端、5′末端。采用ContigExpress軟件分析并拼接各片段, 得到AST基因cDNA序列全長2995 bp, 包括242 bp的5′非編碼區(qū)(Untranslated region, UTR), 2106 bp的開放閱讀框(Open reading flame, ORF)以及647 bp的3′ UTR, 并且3′端具有典型的AATAAA加尾信號。開放閱讀框含有一個(gè)典型的起始密碼子ATG及一個(gè)終止密碼子TAG, 共編碼701個(gè)氨基酸。這些氨基酸的酶切位點(diǎn)為G-K/R-R, 可轉(zhuǎn)錄翻譯出35個(gè)AST多肽, 這些多肽分別由6—18個(gè)氨基酸組成,并且在C末端具有相同的 Y/FXFGL-amide結(jié)構(gòu),屬于A型-AST。青蝦AST基因全長cDNA序列已提交GenBank, 序列號為JQ014170。

2.2 青蝦AST氨基酸序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析

經(jīng)DNAStar軟件分析表明, 青蝦AST多肽前體由701個(gè)氨基酸組成, 經(jīng)蛋白酶水解可轉(zhuǎn)錄并翻譯出35個(gè)AST多肽, 分析顯示這些多肽共30種。使用clustalx軟件將青蝦30種多肽與克氏螯蝦(Procambarus clarkii)、三葉真蟹(Carcinus maenas)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、大海蝦(Panulirus interruptus)、羅氏沼蝦(M. rosenbergii)的AST多肽比對, 得到保守的多肽及氨基酸種類(表2)。

使用clustalx和MEGA4.0軟件, 選取昆蟲綱的果蠅(Drosophila melanogaster) (AF263923.1)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda) (AJ508906.1)、家蠶(Bombyx mori) (AF309090.1)、德國小蠊(Blattella germanica) (AF068061.1)、太平洋折翅蠊(Diploptera punctata) (U00444.1)、長須蜚蠊(Supella longipalpa) (AF068063.1)、埃及伊蚊(Aedes aegypti) (U66841.1)、散白蟻(Reticulitermes flavipes) (FJ668632.1), 以及甲殼綱的大海蝦(Panulirus interruptus) (AB245091.1)、克氏螯蝦(Procambarus clarkii) (AB106899.1)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii) (DQ088626.1)11個(gè)物種的AST氨基酸序列與青蝦的AST氨基酸序列進(jìn)行比對。分析顯示, 青蝦AST氨基酸序列與羅氏沼蝦相似度為100%, 與大海蝦、克氏螯蝦相似度在95%以上, 與太平洋折翅蠊、長須蜚蠊、埃及伊蚊、散白蟻的相似度為85%—95%(表3)。使用MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹[27], 計(jì)算方法采用Bootstrap法重復(fù)計(jì)算1000次。進(jìn)化樹中甲殼綱和昆蟲綱分為兩支, 青蝦與羅氏沼蝦具有最近的親緣關(guān)系, 與昆蟲綱的進(jìn)化關(guān)系相對遠(yuǎn)一些(圖1)。

2.3 青蝦AST基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)分析

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測AST基因在青蝦體內(nèi)不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示, 青蝦AST基因在所有被檢測組織中均有表達(dá), 由高到低依次為:肝胰臟>腸道>精巢>腦>心臟>卵巢(圖2)。在qRTPCR實(shí)驗(yàn)中, 每個(gè)組織及其參照基因分別做了三個(gè)重復(fù), 對得到的三組數(shù)值進(jìn)行T檢驗(yàn)P>0.05, 證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。通過方差分析, AST基因在肝胰臟中的表達(dá)量與其他5 種組織相比存在顯著差異(**P<0.01),而在其他5種組織中均無顯著差異 (P>0.05)。

表2 青蝦AST多肽前體的種類、重復(fù)次數(shù)及相應(yīng)的氨基酸序列Tab. 2 AST and amino acid sequences of M. nipponense AST peptides, as well as their copy numbers

3 討論

3.1 青蝦AST多肽

青蝦AST基因全長cDNA序列共編碼701個(gè)氨基酸, 經(jīng)蛋白酶水解能夠轉(zhuǎn)錄并翻譯出35個(gè)AST多肽, 其中AST-14重復(fù)了4次, AST-27重復(fù)3次,共30種。目前許多甲殼動物的AST多肽已被分離鑒定, 克氏螯蝦鑒定出29個(gè), 三葉真蟹鑒定出20個(gè), 利莫斯螯蝦鑒定出3個(gè), 斑節(jié)對蝦鑒定出40個(gè),大海蝦鑒定出39個(gè), 羅氏沼蝦鑒定出35個(gè)。作者推測, 重復(fù)次數(shù)多的AST多肽可能在AST基因的生理功能中起到某種重要作用, 有待進(jìn)一步研究。

圖1 基于青蝦及其他甲殼動物和昆蟲AST蛋白序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Neighbor-Joining phylogenetic tree analysis of M. nipponense AST protein with related crusteceans and insectas vertebrate AST proteins

圖2 qRT-PCR方法檢測AST基因在青蝦不同組織內(nèi)的表達(dá)(P>0.05)Fig. 2 Expression of AST mRNA in M. nipponense in different tissues by qRT-PCR (P>0.05)

昆蟲AST多肽根據(jù)C末端序列不同, 可以分為三種類型[35]: 從蜚蠊中分離純化出的AST多肽C末端都具有相似的酰胺化的氨基酸序列Y/F-X-F-G-L,稱為A型-AST; 從蟋蟀中分離純化出的AST多肽, C末端都具有另一種酰胺化的氨基酸序列W(X(6)),即B型-AST; 最初由煙草天蛾中分離出的AST多肽, C末端氨基酸未經(jīng)過酰胺化, 為C型-AST。A型-AST是研究最為廣泛的類型, 其Y/F-X-F-G-L序列對于抑制昆蟲咽側(cè)體保幼激素的合成是十分必要的[35]。

在本研究中青蝦AST多肽的C末端都具有酰胺化的氨基酸序列Y/F-X-F-G-L, 屬于典型的A型-AST, 與昆蟲中蜚蠊類AST多肽類型特征一致。其他已報(bào)道的甲殼類AST多肽也為A型。蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)決定其多樣性的功能。因此作者推測, 甲殼類AST多肽可能具有與蜚蠊類AST多肽相似的某種功能。

AST多肽比對分析得到保守的氨基酸分別為Tyr、Ala、Phe、Gly、Leu 五種。青蝦30種AST多肽中, AST-3、8、16、20、24在已知的其他甲殼動物中均未發(fā)現(xiàn), 是青蝦所特有的, 其他25種AST多肽與羅氏沼蝦共有。其中AST-19, 26為青蝦、羅氏沼蝦、斑節(jié)對蝦共同擁有, AST-29為青蝦、羅氏沼蝦、大海蝦共同擁有。青蝦特有的AST多肽可能在蛻皮、生殖或者其他生理過程中起到與其他物種不同的作用。

3.2 系統(tǒng)進(jìn)化

AST氨基酸序列比對和進(jìn)化樹的分支情況顯示,青蝦與羅氏沼蝦的蛋白相似度最高, 此外與克氏螯蝦、大海蝦也具有較高的蛋白相似度。除了甲殼綱動物之間的AST氨基酸序列比對, 本研究還選取了部分昆蟲綱動物與甲殼動物兩兩比對, 蛋白相似度都在60%以上, 由此推測AST多肽在無脊椎動物的進(jìn)化上是相對保守的。甲殼動物和昆蟲都具有周期性蛻皮、產(chǎn)卵繁殖的特性, 具有高蛋白相似度的AST多肽作為調(diào)節(jié)這兩個(gè)重要功能的激素共同存在于甲殼動物和昆蟲中, 也說明甲殼動物和昆蟲的進(jìn)化地位相近, 這與分類學(xué)上甲殼動物和昆蟲同屬于節(jié)肢動物門的分類結(jié)果是一致的。

3.3 組織差異表達(dá)

在昆蟲中, AST多肽被發(fā)現(xiàn)存在于多種組織中。例如檢測到在德國小蠊的腦和腸道和太平洋折翅蠊的卵巢中有大量AST多肽的存在[7,36,34]; 在雙斑蟋蟀的腦、腸道、卵巢、精巢中均有大量AST多肽的存在[9]。在甲殼動物中, 在羅氏沼蝦[37]、利莫斯螯蝦[12]、斑節(jié)對蝦[19]、約拿蟹(Cancer borealis)[22,23]、三葉真蟹[38]的以腦為中心的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中, 都檢測到大量AST多肽, 這與AST多肽是由腦神經(jīng)細(xì)胞分泌是密不可分的。此外, 腸道也是AST的主要分布區(qū), 在利莫斯螯蝦[12]、約拿蟹[22,23]腸道內(nèi)分泌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的AST多肽具有抑制腸道收縮的頻率和幅度的功能[39]。心臟也含有部分AST多肽, 克氏螯蝦心包膜中發(fā)現(xiàn)的AST多肽, 可以影響心臟收縮的頻率[24]。精巢和卵巢含有少量AST多肽, 克氏螯蝦性腺AST多肽研究發(fā)現(xiàn)AST多肽能促進(jìn)甲基法尼酯的產(chǎn)生, 起到明顯的促進(jìn)性腺和卵成熟作用[40]。

以上AST多肽在不同組織中的存在情況都是基于免疫化學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)研究得到的。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了青蝦AST基因在不同組織中的表達(dá)情況。青蝦AST基因在6種被檢測組織中均有表達(dá), 在肝胰臟中表達(dá)量最高, 與其他組織表達(dá)量均達(dá)到極顯著差異, 其次在腸道和精巢中也具有較高的表達(dá)量, 在腦和心臟中的表達(dá)量相對較低,在卵巢的表達(dá)量最低, 組織間差異不顯著?；蚪M織分布表達(dá)情況可能與基因功能相關(guān)聯(lián), AST基因在不同組織中具體的作用與功能還有待進(jìn)一步研究。

本研究采用分段克隆法克隆得到青蝦AST基因全長cDNA序列, 并對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析和探討, 采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了該基因在青蝦不同組織間的差異表達(dá), 研究結(jié)果可為青蝦蛻皮及生殖發(fā)育相關(guān)基因的克隆研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)為青蝦AST基因后續(xù)功能的研究提供了參考資料。

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CLONING, CHARACTERIZATION AND EXPRESSION OF FULL LENGTH cDNA ENCODING ALLATOSTATIN (AST) IN MACROBRACHIUM NIPPONENSE

BU Xian-Fei1, LI Zhen-Zhen2, QIAO Hui2, FU Hong-Tuo1,2, WU Yan2, GONG Yong-Sheng2, JIANG Su-Fei2and XIONG Yi-Wei2
(1. Wuxi Fishery College Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China; 2. Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China)

Allatostatin (AST) is a type of neuropeptide, it is made up of a few to dozens of amino acid. In crustaceans, AST has a significant stimulatory effect on MF synthesis, which involved in moulting and reproduction, so it is suggesting that AST in crustaceans has a positive effect on moulting and reproduction. However, AST gene cloning and expression of crustaceans is rarely reported. To investigate gene cloning and expression of AST cDNA in Macrobrachium nipponense, we cloned AST gene in M. nipponense and used quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to detecting the expression of AST gene in various tissues. The cloned AST cDNA was 2995 bp in length containing a 242 bp 5′untranslated region (UTR), a 647 bp 3′ UTR and a 2106 bp open reading flame (ORF). The ORF encoded a AST precursor polypeptide 701 amino acid residues, which can be hydrolyzed into 35 allatostatins at dibasic cleavage sites. These 35 allatostatins had a C-terminal Y/FXFGL-amide in common, which is the characteristics of A type-AST. On the basis the comparison of the amino acid sequences, five amino acids including Tyr, Ala, Phe, Gly and Leu were considered as conserved amino acids during evolution. According to the phylogenetic tree, the insects and crustaceans were divided into two branches through the comparison between different insect and crustaceans. M. nipponense had a closest relationship with M. rosenbergii. The result of qRT-PCR revealed that AST gene was expressed in all the tested tissues. The tissue’ expression levels of AST were in the decreasing order hepatopancreas, intestines, testis, brain, heart, and ovary. Our research on AST gene clone and expression contributes to further researching of the function of AST in M. nipponense.

Macrobrachium nipponense; Allatostatin (AST); Gene clone; Gene expression

Q78

A

1000-3207(2013)01-0116-09

10.7541/2013.116

2011-09-14;

2012-08-17

國家十二五科技支撐計(jì)劃(2012BAD26B04; 2012BAD25B07); 中央級基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2011JBFA02); 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)科技跨越計(jì)劃(2007年度)資助

卜憲飛(1987—), 女, 吉林人; 碩士; 主要從事水產(chǎn)動物遺傳育種研究。E-mail: buxianfei2005@126.com

傅洪拓(1964—), 男, 湖南長沙人; 研究員, 博士生導(dǎo)師; 研究方向?yàn)樗a(chǎn)動物遺傳育種。Tel：0510-85558835; E-mail: fuht@ffrc.cn