四湖總干渠環(huán)境雌激素不同濃度江段繁殖生物學(xué)比較研究

郭嫦娟 廖 濤 柳 明 謝松光

(1.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),

北京 100049; 3.湖北省環(huán)境科學(xué)研究院, 武漢 430072; 4.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所, 武漢430064;5.中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)

環(huán)境雌激素(Environmental estrogens, EEs)是指干擾生物體內(nèi)源激素的合成、分泌、運(yùn)輸、結(jié)合和代謝等過(guò)程的外源性化學(xué)物質(zhì)[1]。我國(guó)主要河流水系及沿海地區(qū)水體均不同程度受到環(huán)境雌激素的污染。多氯聯(lián)苯(PCBs)、壬基酚、雙酚 A、鄰苯二甲酸酯類等有機(jī)化工原料類一般在南方水體檢出率較高, 有機(jī)氯農(nóng)藥和生活用水排放是這些環(huán)境雌激素的主要來(lái)源[2]。環(huán)境雌激素對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康的影響已受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。

大量實(shí)驗(yàn)室毒性實(shí)驗(yàn)證明, 環(huán)境雌激素影響魚(yú)類的生長(zhǎng)和繁殖[3—5], 這種個(gè)體水平的影響可能進(jìn)一步影響魚(yú)類的種群動(dòng)態(tài)。然而有關(guān)自然水體中環(huán)境雌激素的生物學(xué)效應(yīng)研究還很少。(Hemiculter Leucisculus)隸屬于鯉形目(Cyprinidae)、鯉科(Cyprinidae)、屬, 是生活于水體中上層的小型魚(yú)類, 在我國(guó)分布廣泛[6]。分批產(chǎn)卵, 繁殖季節(jié)為4—8月, 5—6月為盛季。本文選擇湖北省境內(nèi)四湖總干渠, 比較環(huán)境雌激素不同濃度江段繁殖群體的生物學(xué)特征, 為評(píng)價(jià)環(huán)境雌激素對(duì)魚(yú)類的影響效應(yīng)提供自然水體的證據(jù)。

1 研究地點(diǎn)

四湖總干渠源于湖北荊州地區(qū), 經(jīng)潛江、監(jiān)利、洪湖至新灘口匯入長(zhǎng)江, 全長(zhǎng)100多km[7]。沿途城鎮(zhèn)生活污水、工業(yè)廢水和農(nóng)田用水排入總干渠[8]?？偢汕袥](méi)有魚(yú)類放養(yǎng)和漁業(yè)捕撈。

采樣在 A、B、C三個(gè)河段進(jìn)行。其中 A段(30°21′49″N/112°30′12″E)離源頭較近, 水質(zhì)良好; B段(30°11′09″N/112°36′09″E)位于一個(gè)農(nóng)藥廠排污口下方; C 段(30°03′24″N/112°54′21″E)位于某城鎮(zhèn)排污口下方。

2 材料與方法

2.1 主要儀器與試劑

波恩氏液(苦味酸飽和水溶液∶甲醛∶冰醋酸為 15∶5∶1); 肝素鈉溶液(用無(wú)菌水配成 1 mg/mL的濃度, 4℃保存); 5%甲醛溶液, 無(wú)水乙醇, 濃H2SO4(上海國(guó)藥); 雌激素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司); 色譜分析中的乙酸乙酯、甲醇、正己烷為農(nóng)藥級(jí), 乙腈為色譜純。

電子天平 (0.001 g)(SHIMADZU- BL-320H)、GCMS(Agilent 7890A-5975C); Oasis HLB柱(Waters)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX51)、解剖鏡(OLYMPUSSZX16)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(LEICA -RM2235) 。

2.2 樣品采集與處理

采樣于2009年6月19日和20日進(jìn)行, 采用流刺網(wǎng)(長(zhǎng)： 17 m, 寬 1 m, 網(wǎng)目： 2.0 cm)采集繁殖群體, 每個(gè)采樣點(diǎn)采集30尾以上。樣品采集后立即置于冰塊中保存, 帶回實(shí)驗(yàn)室后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)體長(zhǎng)(Standard length, SL, 0.1 mm)、稱體重(Body weight,BW, 0.01 g); 將腹部剖開(kāi), 觀察性腺, 確定性別和性腺發(fā)育狀況; 選擇性腺發(fā)育成熟雌魚(yú), 分離部分卵巢, 稱重后固定于5%的福爾馬林溶液中, 在解剖鏡下測(cè)定卵徑; 取出肝臟、稱重(Liver weight, LW,0.001 g), 肝體指數(shù)(HSI)采用以下公式計(jì)算：

取部分肝臟和精巢組織, 在波恩氏液中固定12—24h后, 轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中保存, 用于組織切片和觀察。切片時(shí)依次采用乙醇梯度濃度脫水, 二甲苯透明, 石蠟包埋, 切片, 烘片, 二甲苯脫蠟、系列乙醇復(fù)水, 蘇木精—伊紅染色, 乙醇脫水、二甲苯透明, 中性樹(shù)膠封片, 在顯微鏡下觀察并拍照。

魚(yú)類采集同時(shí)用采水器采集表層水樣 3 L, 現(xiàn)場(chǎng)用濃硫酸固定, 采用0.45 μm濾膜過(guò)濾, 用濃硫酸將pH調(diào)為3左右, 保存于4℃, 48h內(nèi)進(jìn)行環(huán)境雌激素分析。測(cè)定時(shí)采用固相萃取方法對(duì)樣品進(jìn)行濃縮分離, 采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 GC-MS的方法測(cè)定水樣中環(huán)境雌激素濃度[9]。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用嵌套方差分析(Nested ANOVA)檢驗(yàn)不同樣點(diǎn)間卵徑差異顯著性。采用雙因子方差分析(Twoway ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD)檢驗(yàn)不同樣點(diǎn)、性別的HSI的差異顯著性。顯著性檢驗(yàn)的顯著水平為P<0.05。統(tǒng)計(jì)分析采用 STATISTICA 6.0進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 不同江段內(nèi)分泌干擾物濃度

A河段水樣中沒(méi)有檢測(cè)出環(huán)境雌激素, B、C兩河段水樣中均檢測(cè)出壬基酚和雙酚A兩種環(huán)境雌激素, B、C兩河段間兩種污染物濃度均無(wú)顯著性差異(表 1)。

樣點(diǎn)對(duì)卵徑存在顯著的影響(Nested ANOVA,P<0.05), 多重比較表明A樣點(diǎn)卵徑平均值顯著大于B、C樣點(diǎn), B、C樣點(diǎn)間卵徑平均值差異不顯著(表1)。

3.3 肝體指數(shù)和肝臟切片

采樣點(diǎn)和性別對(duì)HSI均存在顯著差異(two-way ANOVA)。A樣點(diǎn)雌性和雄性個(gè)體的HSI均顯著低于B、C樣點(diǎn)(P<0.05); 三樣點(diǎn)中雌性個(gè)體的肝體指數(shù)均顯著高于雄性個(gè)體(P<0.05)(表1)。

表1 湖北四湖總干渠不同采樣江段(A、B、C)環(huán)境雌激素水平和繁殖群體的生物學(xué)特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

表1 湖北四湖總干渠不同采樣江段(A、B、C)環(huán)境雌激素水平和繁殖群體的生物學(xué)特征Tab.1 The levels of environmental estrogen in the water and the reproductive characteristics of Hemiculter leucisculus at the three sampling sections (A, B and C) in the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

注： 同一行中平均數(shù)上標(biāo)小寫(xiě)英文字母不同, 表示差異顯著(P<0.05); 同一列中肝體指數(shù)平均數(shù)上標(biāo)大寫(xiě)英文字母不同, 表示雌雄個(gè)體間差異顯著(P<0.05)Note： Means in a row with different superscripts of lower letlers are significantly different from each other (P<0.05); Means of Hepato somatic Index in a column with different superscripts of capital letters are significantly different from each other (P<0.05)

A B C雙酚 A(μg/L) Bisphenol A — 7.30±1.91 3.15±1.11環(huán)境雌激素水平Environmental estrogen level 壬基酚(μg/L) Nonylphenol — 12.84±3.49 18.12±2.84雌性個(gè)體百分比(%) Female percentage 38.02 58.93 61.11卵徑(mm) Egg diameter 0.67±0.08a 0.50±0.05b 0.51±0.04b肝體指數(shù)(♀) Hepatosomatic Index 1.44±0.94aA 2.56±0.57bA 2.70±0.44bAimages/BZ_324_259_2724_293_2754.png繁殖群體生物學(xué)指標(biāo)Reproductive characteristics肝體指數(shù)(♂) Hepatosomatic Index 0.95±0.54aB 1.40±0.58bB 1.68±0.48bB

圖1 四湖總干渠不同江段肝臟組織切片顯微照片F(xiàn)ig.1 The liver histological pictures of Hemiculter leucisculus from different sections of the Main Irrigation Channel of the Four-lake area in Hubei Province

3.4 精巢切片

4 討論

四湖總干渠源頭A江段水體未檢測(cè)出環(huán)境雌激素, 而B(niǎo)、C兩江段主要含有壬基酚和雙酚A, 兩種污染物總濃度均在20 μg/L左右。與A江段相比, B、C江段繁殖群體中雌性個(gè)體的比例明顯較高, 卵粒較小; 雄性個(gè)體精巢中空增大, 結(jié)締組織壞死或斷裂, 精原細(xì)胞和精子細(xì)胞密度低; 肝體指數(shù)增大、肝組織出現(xiàn)大量空泡, 肝細(xì)胞密度降低、細(xì)胞核不明顯等特點(diǎn)。壬基酚和雙酚A等一類污染物已經(jīng)被證明具有顯著雌激素活性[10,11]。由于這些環(huán)境雌激素化學(xué)結(jié)構(gòu)與魚(yú)體內(nèi)生理合成的雌激素十分相似,可以與體內(nèi)雌激素受體結(jié)合, 影響相關(guān)內(nèi)源雌激素的合成、釋放、輸送、代謝、結(jié)合、作用或消除過(guò)程, 進(jìn)而影響魚(yú)類的早期生長(zhǎng)發(fā)育、性別分化、繁殖等[12,13]。雙酚A對(duì)斑馬魚(yú)的生殖有明顯的抑制作用, 而壬基酚和雙酚A具有協(xié)同效應(yīng)甚至中斷生殖行為[14]。B、C江段水體中壬基酚和雙酚 A濃度較高可能是導(dǎo)致繁殖群體生物學(xué)特征改變的重要原因。

水體中的環(huán)境雌激素能夠影響魚(yú)類性別決定過(guò)程, 對(duì)魚(yú)類產(chǎn)生明顯的雌性化效應(yīng), 改變魚(yú)類個(gè)體內(nèi)源激素表達(dá)水平, 從而引起種群性比改變。如英國(guó)調(diào)查報(bào)告表明, 生活在工廠排污河流的石斑魚(yú)發(fā)生了嚴(yán)重的雌性化現(xiàn)象[15], 在諾?？丝さ陌瑺柡佑^測(cè)點(diǎn), 接受調(diào)查的雄性石斑魚(yú) 60%出現(xiàn)了雌性化的特征, 雌性石斑魚(yú)比例顯著高于對(duì)照點(diǎn)[16]。在本研究中B、C江段繁殖群體的雌性個(gè)體比例較高可能與該江段中壬基酚和雙酚A的雌激素效應(yīng)相關(guān), 與以上文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

精巢是環(huán)境雌激素可以直接產(chǎn)生作用的靶器官。Bjerselius,et al.[17]和Gimeno,et al.[18]分別發(fā)現(xiàn)雌激素暴露下的雄性鯽魚(yú)和雄性鯉魚(yú)都會(huì)產(chǎn)生精子數(shù)量下降, 甚至沒(méi)有精液的現(xiàn)象。Jobling,et al.發(fā)現(xiàn)暴露在壬基酚中的虹鱒雄性生殖腺的生長(zhǎng)受抑制[19]。雙酚A對(duì)斷乳期F1雄性子代大鼠生殖和發(fā)育有影響, 可能導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡增強(qiáng), 增殖減慢, 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)受阻[20]。隨著環(huán)境雌激素濃度的增加,有可能使動(dòng)物精巢中的一些細(xì)胞凋亡或者壞死的速度增加[21]。在本研究中環(huán)境雌激素污染物濃度較高的 B、C江段精巢組織結(jié)構(gòu)破壞與以上環(huán)境雌激素效應(yīng)一致。

進(jìn)入生物體內(nèi)的壬基酚和雙酚A必須通過(guò)肝臟的代謝才能排除體外, 在內(nèi)分泌干擾物的刺激下,混合功能氧化酶等肝臟解毒酶的誘導(dǎo)效應(yīng)致使肝細(xì)胞腫大, 肝臟增大[22]。劉萍發(fā)現(xiàn)暴露于壬基酚、雙酚A、辛基酚和17β-雌二醇這四種化合物中的金魚(yú)HSI較對(duì)照組顯著升高[23]。而 B、C點(diǎn)肝臟細(xì)胞腫大, 核萎縮變形, 細(xì)胞空泡化以及局部肝組織壞死, 與環(huán)境雌激素作為外源異生物質(zhì)在肝中的代謝密切相關(guān)。

雖然已經(jīng)有很多受控實(shí)驗(yàn)證明環(huán)境雌激素對(duì)魚(yú)類繁殖的影響, 但野外原位實(shí)驗(yàn)直接證據(jù)還較少。本研究顯示在自然環(huán)境中, 環(huán)境雌激素濃度較高的水體, 魚(yú)類繁殖群體的繁殖生物特征顯著改變, 可能導(dǎo)致魚(yú)類精子和卵子質(zhì)量降低、繁殖成功率下降等, 從而影響魚(yú)類種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)。很多天然水體都受到環(huán)境雌激素不同程度的污染, 如我國(guó)黃河口表層水體壬基酚平均值為47.5 ng/L[25], 珠江三角洲河段為 0.02—0.165 μg/L[26], 北黃海近岸濃度為15.13—762.73 ng/L[27]。有關(guān)環(huán)境雌激素污染物對(duì)魚(yú)類種群動(dòng)態(tài)的影響需要通過(guò)研究環(huán)境雌激素污染水體相關(guān)魚(yú)類的種群動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)一步闡述。

[1] Campbell C G, Borglin S E, Green F B,et al.Biologically directed environmental monitoring, fate, and transport of estrogenic endocrine disrupting compounds in water： a review[J].Chemosphere, 2006, 65(8)： 12651280

[2] Zhang Q, Bao L Y, Liu W J,et al.Current status of endocrine disrupting chemicals pollution in drinking water source of China [J].Environmental Science & Technology, 2011,34(2)： 9196 [張琴, 包麗穎, 劉偉江, 等.我國(guó)飲用水水源內(nèi)分泌干擾物的污染現(xiàn)狀分析.環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2011,34(2)： 9196]

[3] Lauren T Moffatt, Chelsea L May, Kirsten E Studer,et al.Effects of exposure water volume, depuration time, and feeding status on vitellogenin mRNA induction in male medaka(Oryzias latipes) exposed to 17 β-estradiol [J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2010, 73(8)： 18351841

[4] Andersen L, Holbech H, Gessbo A,et al.Effects of exposure to 17a-ethinylestradiol during early development on sexual differentiation and induction of vitellogenin in zebrafish(Danio rerio) [J].Comparative Biochemistry and Physiology,Part C： Toxicology and Pharmacology, 2003, 134(3)： 365374

[5] Kang I J, Yokota H, Oshima Y,et al.Effect of 17 β-estradiol on the reproduction of Japanese medaka (Oryzias latipes) [J].Chemosphere, 2002, 47(1)： 7180

[6] Zhu S Q.Synopsis of Freshwater Fishes in China [M].Nanjing： Jiangsu Science and Technology, 1995, 39 [朱松泉.中國(guó)淡水魚(yú)類檢索.南京： 江蘇科學(xué)技術(shù)出版社.1995, 39]

[7] Li C F, Zhang H H.A study on the effect of human activities on water environment in Four Lake area since 1950s [J].Territory & Natural Resources Study, 2003, (4)： 6870 [李昌峰, 張鴻輝.建國(guó)以來(lái)人類活動(dòng)對(duì)湖北省四湖地區(qū)水環(huán)境的影響研究.國(guó)土與自然資源研究, 2003, (4)： 6870]

[8] Anna-Kristina B, Peter B.Quantification of anthropogenic threats to lake in a low and county of central Sweden [J].A Journal of The Human Environment, 2001, 30(3)： 127128

[9] Takeda S, Iida S, Chayama K,et al.Separation of bisphenol A and three alkylphenols by micellar electrokinetic chromatography [J].Journal of Chromatography Part A, 2000,895(1/2)： 213218

[10] Drastichova D, Svobodova Z,et al.Effect of exposure of bisphenol A and 17β-estradiol on the sex differentiation in zebrafish (Danio rerio) [J].Acta Veterinaria Brno, 2005,74(2)： 287291

[11] Hill R L, Janz D M.Developmental estrogenic exposure in zebrafish (Danio rerio)： I.Effects on sex ratio and breeding success [J].Aquatic Toxicology, 2003, 63(3)： 417429

[12] Liu A P, Wang W M.Influence of Endocrine Disrupting Chemicals on fish [J].Reservoir Fisheries,2007, 27(1)： 13[劉阿朋, 王衛(wèi)民.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)魚(yú)類的影響.水利漁業(yè), 2007, 27(1)： 1—3]

[13] Xia J G, Niu C J, Fu J H,et al.Ecotoxicological effects of exposure to nonylphenol on courtship behavior of zabrafishDanio rerio[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(6)：1142—1148 [夏繼剛, 牛翠娟, 傅俊華, 等.壬基酚對(duì)斑馬魚(yú)求偶行為的生態(tài)毒理效應(yīng).水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(6)：1142—1148]

[14] Cao N, Wei H, Wu L G,et al.Effects of bisphenol A on zebrafish (Danio rerio) liver and gonad [J].Chinese Journal of Ecology, 2010, 29(11)： 2192—2198 [曹娜, 魏華, 吳陵廣,等.雙酚 A對(duì)斑馬魚(yú)肝臟和性腺的作用.生態(tài)學(xué)雜志,2010, 29(11)： 21922198]

[15] Petrovic, Eljarrat, Alda,et al.Recent advance in the mass spectrometric analysis related to endocrine disrupting compounds in aquatic environmental samples [J].Journal of Chromatography A, 2002, 974(1/2)： 2329

[16] Korsgarrs, Andreassen, Rasmussen.Effect of an environmental estrogen, 17α-ethinyl-estradiol, on the matemal-fetal trophic relationship in the eelpoutZoarces viviparous(L) [J].Marine Environmental Research, 2002, 54： 735739

[17] Bjerselius R, Lundstedt-Enkel K, Olsen H,et al.Male goldfish reproductive behaviour and physiology are severely affected by exogenous exposure to 17β-estradiol [J].Aquatic Toxicology, 2001, 53(2)： 139152

[18] Gimeno S, Komen H.Feminisation of young males of the common carp,Cyprinus carpio, exposed to 4-tert-pentylphenol during sexual differentiation [J].Aquatic Toxicology,1998, 43(1)： 7792

[19] Jobling S, Tyler C R.Endocrine disruption in wild freshwater fish [J].Pure and Applied Chemistry, 2003, 75(11)： 22192234

[20] Lü B, Cao X Q, Yao Y G,et al.The effects of bisphenol a on the reproduction and development of F1 male rats furing weaning period [J].Modern Preventive Medicine,2010,37(12)： 22162219 [呂波, 曹顯慶, 姚永革, 等.雙酚 A對(duì)斷乳期SD大鼠F1子代雄性生殖發(fā)育影響.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 37(12)： 22162219]

[21] Harries J E, Runnalls T, Hill E,et al.Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas) [J].Comparative Environmental Science Technology,2000, 34(15)： 30033011

[22] Fang JKF, Au DWT, Wu RSS,et al.The use of physiological indices in rabbitfishSiganus oraminfor monitoring of coastal pollution [J].Marine Pollution Bulletin, 2009, 58(8)：12291244

[23] Liu P, Li Z Y, Li J L.Estrogenic effects of vitellogenin induction in goldfish caused by phenolic compounds [J].Periodical of Ocean University of China, 2010, 40(11)： 134140 [劉萍, 李正炎, 李江玲.酚類污染物對(duì)金魚(yú)卵黃蛋白原誘導(dǎo)的雌激素效應(yīng)研究.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,40(11)： 134140]

[24] Yin M C.Fishes Ecology [M].Beijing： Chinese Agricultural.1995, 134272 [殷名稱.魚(yú)類生態(tài)學(xué).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社.1995, 134272]

[25] Sun P Y, Li Z Y, Wang X P.Distribution characteristics of nonylphenol pollutant in the yellow river mouth area [J].Coastal Engineering, 2007, 26(3)： 1722[孫培艷, 李正炎,王鑫平.黃河入?？谌苫游廴痉植继卣?海岸工程,2007, 26(3)： 1722]

[26] Duan J C, Chen B, Mai B X,et al.Survey of Alkylphenols in aquatic environment of Zhujiang Delta [J].Environmental Science, 2004, 25(3)： 4852 [段菁春, 陳兵, 麥碧嫻, 等.洪季珠江三角洲水系烷基酚污染狀況研究.環(huán)境科學(xué),2004, 25(3)： 4852]

[27] Liu W P, Shi X Y, Wang X B,et al.Survey of nonylphenol in Liaoning coastal aquatic environment of North Yellow Sea and the ecological risk assessment [J].Marine Environmental Science, 2009, 28(6)： 664667 [劉文萍, 石曉勇, 王曉波,等.北黃海遼寧近岸水環(huán)境中壬基酚污染狀況調(diào)查及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.海洋環(huán)境科學(xué), 2009, 28(6)： 664667]