長江屏山江段犁頭鰍種群的遺傳結構

程 飛柳 明吳清江謝松光

長江屏山江段犁頭鰍種群的遺傳結構

程 飛1,2柳 明1吳清江1謝松光1,3

(1. 中國科學院水生生物研究所, 中國科學院水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 中國科學院水生生物研究所淮安研究中心, 淮安223002)

長江上游是我國淡水魚類資源最為豐富的地區(qū)之一,已記錄魚類261種; 同時, 該江段也是我國特有魚類最為集中的江段, 分布特有魚類112種[1]。這一江段水流湍急,灘潭交錯, 流態(tài)復雜多樣。很多魚類在生理、形態(tài)和生活史特征等方面表現(xiàn)出與該江段特殊的棲息地環(huán)境相適應的特化[2]。目前長江上游金沙江江段在建的水電站至少有兩座(向家壩、洛溪渡), 規(guī)劃建設的還有十余座[3]。這些水電站的建設和運行將極大地改變上游水文環(huán)境, 對上游魚類(特別是特有魚類)產(chǎn)生顯著影響。

犁頭鰍Lepturichthys fimbriata (Günther) 隸屬鯉形目(Cypriniformes)爬鰍科(Balitoridae)平鰭鰍亞科(Homalopterinae) 犁頭鰍屬 (Lepturichthys), 是長江特有魚類[4]。犁頭鰍是生活于急流石灘的底棲小型魚類, 利用寬大平展的偶鰭和平坦裸露的胸腹部適應急流生境[5]。金沙江犁頭鰍的生殖季節(jié)為4月中旬至6月中旬, 在峽谷江段產(chǎn)漂流性卵[6]。犁頭鰍是一種非漁業(yè)對象的小型特有魚類, 是監(jiān)測和研究環(huán)境變化對魚類影響的理想材料之一。但迄今為止, 犁頭鰍的相關遺傳結構研究還是空白。本文利用線粒體DNA(mtDNA)的細胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因的部分序列, 研究了金沙江下游屏山江段犁頭鰍的遺傳結構, 為評估和監(jiān)測金沙江水電梯級開發(fā)對犁頭鰍種群遺傳結構的影響提供本底資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2008年5月至7月于長江屏山江段(28o60′N, 104o10′ E)采集漂浮性仔魚樣品(圖 1)。采樣工具為自制的定置網(wǎng),類似于長江中下游傳統(tǒng)捕苗工具弶網(wǎng); 網(wǎng)目40目, 網(wǎng)口呈長方形, 寬2.0 m, 深1.5 m, 全長2.5 m。網(wǎng)具24h固定于江邊緩流區(qū), 浮于水面, 每天上午(10:00)、下午(5:00)各取樣一次。同時, 在屏山江段漁獲物中收集犁頭鰍成魚樣品。所有樣品均在95%的酒精中保存, 置于4℃冰箱中。

1.2 犁頭鰍仔魚的鑒定

測定個體mtDNA COⅠ基因5′端的部分序列, 計算Kimura雙參數(shù)遺傳距離(K2P Distance), 分析序列間的分化[7]; 基于魚類barcoding研究結果[8], 將與犁頭鰍成魚K2P距離小于2%的仔魚個體確定為犁頭鰍仔魚。

圖 1 長江上游屏江江段犁頭鰍種群樣品采樣位置()和兩座在建的大壩 ()Fig. 1 Sampling location () for Lepturichthys fimbriata population in the Pingshan section and the locations of the two dams under construction () in the upper Yangtze River

1.3 DNA提取與擴增

隨機選取1000尾仔魚 (3.3—18.8 mm TL) 和12尾犁頭鰍成魚 (67—108 mm TL)。利用高鹽法提取仔魚個體和成魚鰭條的總DNA, 瓊脂糖電泳檢測DNA質(zhì)量和濃度。PCR擴增各樣品的mtDNA COⅠ基因; 擴增引物采用FishF1 & FishR1; 引物序列、反應體系和程序參見Ward, et al.[8]。擴增使用Bio-Rad PCR儀(Bio-Rad, PTC-100)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后, 純化目標片段, 再利用擴增引物測序。測序由北京華大基因研究中心完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Clustal X v 1.83[9]對序列數(shù)據(jù)進行全序列比對, 剪除兩端不可靠堿基, 并加以人工校正。將堿基序列翻譯成氨基酸, 以檢驗測序錯誤和假基因(Pseudogenes)。利用軟件MEGA 4.0[10]計算Kimura K2P 距離, 分析序列間的分化, 并統(tǒng)計序列的堿基組成。

利用軟件DnaSP v 5.1[11]檢測犁頭鰍仔魚與成魚的群體分化水平, 如果無顯著性分化, 則作為一個群體分析;若存在顯著分化, 則分為兩個群體分析。同時利用該軟件計算遺傳多樣性指數(shù), 包括單倍型數(shù)目(Haplotype number, k)、單倍型多樣性(Haplotypic diversity, h)、平均核苷酸差異數(shù)(Average pairwise sequence differences, П)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity, π)。

利用軟件STRUCTURE v 2.3[12]檢驗犁頭鰍樣品遺傳分化群。從1到10分別運算遺傳分化群(K)的可能性, 根據(jù)K的后概率值判定樣品的遺傳分化[12,13]。檢驗基于Bayesian判別的混合模型, 馬爾科夫鏈的設置為5 × 105迭代, 5次重復。

如果犁頭鰍樣品存在遺傳分化, 則將每一個遺傳分化群視作一個群體。利用軟件DnaSP v 5.1計算各群體的遺傳多樣性指數(shù)k、h、П和π; 并采用Tajima以及Fu & Li的檢驗方法[11], 檢測群體DNA水平的自然選擇作用。利用軟件ARLEQUIN v 3.1[14]統(tǒng)計各種群間的遺傳分化水平, 并采用分子變異梯度分析(Hierarchical analysis of molecular variance, AMOVA)檢測遺傳變異來源; 分析設置1 × 104次置換檢驗。

利用軟件TCS 1.21[15]分析犁頭鰍各單倍型的進化網(wǎng)絡, 置信區(qū)間為95%。

2 結果

共成功擴增824尾仔魚和12尾犁頭鰍成魚序列, 擴增長度在750 bp左右。對序列進行比對、分析和人工校正后, 長584 bp的堿基用于后續(xù)分析。584 bp序列中沒有插入和缺失, 也不包含移框突變和終止密碼子。根據(jù)2%K2P距離的標準, 共有57尾仔魚被鑒定為犁頭鰍, 仔魚平均K2P距離是0.8%。57尾犁頭鰍仔魚最早出現(xiàn)時間是5月9號, 最晚時間是7月4號; 在6月1號出現(xiàn)一個明顯的苗汛高峰。

在仔魚和成魚共69尾犁頭鰍序列中, 檢測到一尾仔魚存在一個氨基酸替換(val → lys), 即84號密碼子第一位置的堿基G轉(zhuǎn)換成A, 其余個體均沒有氨基酸變化。堿基組成T、C、A、G平均含量分別是27.1%、28.5%、26.2%、18.2%, A + T含量明顯高于C + G含量。

卡方檢驗表明, 仔魚與成魚沒有顯著的群體分化(P = 0.776, df = 21), 因此, 合并為一個群體分析。584 bp序列含有33個(占全系列5.7%)多態(tài)位點, 其中21個(占3.6%)是簡約性信息位點。遺傳多樣性指數(shù)k、h、П和π分別是22 (Hap 1—22, GenBank No:JN830334 – JN830355)、0.882、4.076和0.007。

Bayesian判別檢驗表明, ln P(D)在K = 3出現(xiàn)最大值(圖 2A), 69尾犁頭鰍可以分為3個(K = 3)遺傳分化群(圖2B), 記為sub1、sub2和sub3, 分別包含27、33和9尾個體。3個群體間遺傳分化顯著, 尤其是sub3與另兩個群體的分化極為顯著, 其配對分化分別是0.842、0.891(P < 0.001,表 1)。AMOVA分析表明, 群體間的變異占整個遺傳變異的73.3%, 而來源于各群體內(nèi)的變異占26.7% (表 2)。

22種單倍型在三個群體內(nèi)分布極不平均, 只有一種單倍型(Hap 2)為sub1和sub2共享, 其余單倍型分別為不同群體獨有。在3個群體中sub2的各多樣性指數(shù)均表現(xiàn)為較低或最低(表3)。

Tajima 檢驗和Fu & Li 檢驗的P值均大于0.1, 表明犁頭鰍各群體內(nèi)mtDNA進化遵循中性模型。

TCS分析顯示22種單倍型分為兩個進化枝, 一個進化枝是群體sub3, 包括Hap15—19, 共5種單倍型, sub3的單倍型沿單一進化方向經(jīng)歷了多次突變, 明顯與其他群體分離; 另一個進化枝包括其余17種單倍型, 分布在sub1和sub2之中(圖3)。單倍型Hap2是犁頭鰍最常見和原始單倍型, 也是唯一共享單倍型。

圖 2 利用軟件Structure v 2.3的混合模型分析長江上游屏江江段犁頭鰍種群的遺傳分化群Fig. 2 Varied curve of [lnP(D)] and inferred genetic clusters of the Bayesian clustering analysis of Lepturichthys fimbriata population in the Pingshan section of the upper Yangtze River performed with STRUCTURE 2.3

表1 長江上游屏山江段犁頭鰍種群3個遺傳分化群體間的配對分化系數(shù)(Fst)Tab. 1 Pairwise Fstvalues among the three genetic groups (Sub 1-3) of Lepturichthys fimbriata in the Pingshan section of the upper Yangtze River

表2 長江上游屏江江段犁頭鰍種群3個遺傳分化群體分子變異梯度分析Tab. 2 Hierarchical analysis of molecular variance for the three genetic groups of Lepturichthys fimbriata in the Pingshan section of the upper Yangtze River

表3 長江上游屏江江段犁頭鰍種群3個不同遺傳群體的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 3 Genetic diversity indices of the three genetic groups of Lepturichthys fimbriata in the Pingshan section of the upper Yangtze River

3 討論

對犁頭鰍種群分化的研究結果表明, 在采集的樣品中存在遺傳分化顯著的3個群體(表1)。共享單倍型數(shù)目及Tajima 檢驗和Fu & Li 檢驗的結果均顯示群體間缺乏基因流。這些結果說明研究江段犁頭鰍種群存在具有一定遺傳隔離的不同群體。魚類的這種多遺傳群體結構現(xiàn)象可能較為普遍[如鯡魚 (Clupea harengus)[16]、紅大馬哈魚(Oncorhynchus nerka)[17]]。在對具有多個遺傳隔離群體的魚類進行管理和保護時, 如果將其視為單一的管理單位 (Management unit, MU), 極有可能導致特定群體的消失[17,18]。加拿大Newfoundland & Labrador海域的鱈魚(Gadus morhua)由若干遺傳分化的群體組成, 由于對其多群體結構認識不足, 之前一直作為單一管理單位進行管理, 過度捕撈導致多個補充能力弱的亞群體消失或嚴重受損, 導致加拿大鱈魚漁業(yè)在1992年幾近崩潰, 其后雖經(jīng)十多年的努力, 資源恢復緩慢[19]?？紤]到長江上游豐富的特有魚類和生境多樣性, 與犁頭鰍相似包含具有一定遺傳隔離的多群體魚類種類可能較為普遍。

遺傳多樣性指數(shù)π是度量mtDNA變異程度的主要指標之一, 其值的大小表示群體多態(tài)程度的高低[20]。盡管全部犁頭鰍個體的π值(0.007)顯示該物種的遺傳多樣性較高, 但3個分化群體的π值介于0.002—0.004之間(表 3),各群體內(nèi)的遺傳多樣性并不高, 明顯小于一級保護魚類中華鱘Acipenser sinensis 的遺傳多樣性(π值: 0.008—0.016)[21]和二級保護魚類胭脂魚Myxocyprinus asiaticus的遺傳多樣性(π值: 0.008—0.052)[22]。由于群體間的顯著分化, 基因流缺乏, 對犁頭鰍種群的遺傳多樣性及種群對環(huán)境變化的潛在適應能力評價應該以各群體內(nèi)(即MU)遺傳多樣性的大小為主。

圖 3 長江上游屏江江段犁頭鰍種群單倍型的簡約進化網(wǎng)絡圖Fig. 3 Statistical parsimony network based on haplotype frequencies of Lepturichthys fimbriata population in the Pingshan section of the upper Yangtze River

大壩的建設和運行是淡水魚類生物多樣性主要威脅之一[23]。梯級水電站的建設和運行將極大地改變長江上游魚類的棲息環(huán)境, 是長江上游魚類資源(特別是特有魚類)的重要威脅。本研究表明, 長江上游犁頭鰍種群包含具有一定遺傳隔離, 遺傳分化明顯的多個群體, 且各群體內(nèi)的遺傳多樣性較低。對于這種由多個群體構成的魚類種群, 梯級大壩建設有可能導致各群體遺傳多樣性的下降, 甚至個別群體滅絕, 并進一步加快群體分化過程。有關這類魚類種群的遺傳結構及各群體的生物學特征研究,對評價大壩建設對這類種群的影響, 進而制定科學的保護和管理措施具有十分重要的意義。

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GENETIC STRUCTURES OF LEPTURICHTHYS FIMBRIATA POPULATION IN THE PINGSHAN SECTION OF THE YANGTZE RIVER

CHENG Fei1,2, LIU Ming1, WU Qing-Jiang1and XIE Song-Guang1,3
(1.State Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Huai’an Research Center, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Huai’an 223002, China)

犁頭鰍; COⅠ; 遺傳分化; 遺傳多樣性; 長江上游

Lepturichthys fimbriata; COⅠ; Genetic differentiation; Genetic diversity; The upper Yangtze River

Q346

A

1000-3207(2013)01-0145-05

10.7541/2013.145

2011-10-18;

2012-10-16

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(2010CB429000); 大自然保護協(xié)會(TNC)項目; 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室開放課題(Y15C01); 中國科學院“百人計劃”擇優(yōu)支持項目; 湖北省博士后科技活動擇優(yōu)資助; 國家自然科學基金(No. 51209202); 中國博士后科學基金(20100480924)資助

程飛(1977—), 男, 湖北黃陂人; 博士研究生; 主要從事魚類生態(tài)學研究。E-mail: chengfei@ihb.ac.cn

謝松光, 研究員, 博士生導師; E-mail: xiesg@ihb.ac.cn