微囊藻毒素-LR對(duì)大鼠行為認(rèn)知能力及血腦屏障通透性的影響

李洋，周玨，孫冰，李雪珂，李云暉

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210009)

微囊藻毒素(MCs)可以導(dǎo)致多器官毒性[1]。迄今已從微囊藻和其它藍(lán)藻中分離鑒定了近80種MC同系物[2]，其中在環(huán)境中存在較為普遍的有MC-LR和MC-RR，尤以MC-LR含量最多、毒性最大[3]。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，MC-LR還可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能產(chǎn)生損害作用[4]。而目前有關(guān)MC-LR神經(jīng)毒性以及相關(guān)毒性作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。

血腦屏障(blood brain barrier，BBB)保持著中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接是保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)之一。將MCs靜脈注射入大鼠體內(nèi)后，在腦內(nèi)可以檢測(cè)到少量 MCs的蓄積[5]，由此提示 MCs可能會(huì)透過(guò) BBB而進(jìn)入腦內(nèi)。本研究利用水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，研究MC-LR對(duì)大鼠的認(rèn)知和自發(fā)行為的影響，通過(guò)觀察大鼠染毒后的BBB通透性，為研究MC-LR對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠40只，體重80～100 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑與儀器

MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品、伊文思藍(lán)(EB，美國(guó)Sigma公司)，UV-2100型紫外2可見分光光度計(jì)(中美合資UNICO)，Ethovision XT行為學(xué)分析系統(tǒng)(荷蘭Noduls公司)。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)和分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)環(huán)境為18～23℃，相對(duì)濕度45%～55%。適應(yīng)環(huán)境1周之后按體重隨機(jī)分為4組，每組10只。灌胃染毒，染毒時(shí)間3個(gè)月。3個(gè)劑量組染毒劑量依次為 0.13、0.5、20 μg·kg－1MC-LR。對(duì)照組注射相同體積0.9%生理鹽水。染毒期間，大鼠自由攝食和飲水。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮由1個(gè)圓形水池(直徑160 cm)、圖像采集系統(tǒng)、電腦操作分析系統(tǒng)組成，是研究動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶功能常用的經(jīng)典模型工具[6]。水迷宮水池分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)象限。水溫保持在22～26℃，排除環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。使用Noldus公司開發(fā)的動(dòng)物行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng)Ethovision TX 7.0軟件分析結(jié)果。

1.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將小鼠放入曠場(chǎng)的正中央格并開始計(jì)時(shí)，觀察大鼠在5 min內(nèi)的行為，記錄大鼠在5 min內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離、在中央?yún)^(qū)域和周圍區(qū)域的次數(shù)、運(yùn)動(dòng)行為(包括站立、修飾等行為)的持續(xù)時(shí)間。

1.6 EB測(cè)定BBB通透性變化

各組大鼠處死前股靜脈注入2%EB 2 ml·kg－1，經(jīng)心臟灌注生理鹽水后迅速斷頭取腦，分離左右半球，按1 ml·(100 mg)－1腦組織加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提 24 h，1 000 r·min－1離心 5 min，用 Spectronic 21型紫外可見分光光度計(jì)在620 nm處測(cè)光密度值，計(jì)算各組腦組織EB含量(μg·g－1)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MC-LR對(duì)大鼠學(xué)習(xí)能力的影響

表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠平均逃避潛伏期總體呈下降趨勢(shì)。但各染毒劑量MC-LR組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 MC-LR對(duì)大鼠記憶能力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)各組總游程和游速進(jìn)行比較顯示，高劑量MC-LR組在相同時(shí)間內(nèi)的總游程和游速比對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)。各染毒劑量MC-LR組穿越平臺(tái)次數(shù)雖然比對(duì)照組有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且各劑量MC-LR組大鼠在平臺(tái)象限停留時(shí)間和對(duì)照組相比并無(wú)變化。

2.3 MC-LR暴露3個(gè)月后大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高劑量MC-LR組大鼠5 min內(nèi)在敞箱里的總運(yùn)動(dòng)路程和運(yùn)動(dòng)行為的持續(xù)時(shí)間明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。高劑量MC-LR組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間明顯減少，在邊緣區(qū)域的行為增多，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠不同時(shí)段平均逃避潛伏期比較(±s，n=10)秒Tab 1 The comparison of escape latency of different groups(±s，n=10) s

表1 各組大鼠不同時(shí)段平均逃避潛伏期比較(±s，n=10)秒Tab 1 The comparison of escape latency of different groups(±s，n=10) s

組 別不同時(shí)段平均逃避潛伏期第1天 第2天 第3天 第4天±6.91 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 97.25±13.08 73.61±16.53 50.02±13.34 40.99±11.53 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 98.23±15.40 62.45±15.67 41.55±14.01 34.83±10.21 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 93.12 ±19.52 73.13 ±8.09 56.21 ±15.42 30.60 ±7.33對(duì)照組 100.41±15.32 64.85±16.23 47.75±11.95 21.74

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab 2 The comparison of spatial probe test of different groups(±s，n=10)

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab 2 The comparison of spatial probe test of different groups(±s，n=10)

a與對(duì)照組比較，P＜0.05

組 別 總游程/cm 游速/cm·s－1 穿越平臺(tái)次數(shù) 平臺(tái)象限停留時(shí)間13.07 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 2 469.97±276.28 20.58±2.30 16.6±6.87 46.40±11.91 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 2 466.07±230.87 20.55±1.92 15.5±4.74 45.19±12.47 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 2 577.79 ±177.07a 21.48 ±1.48a/s對(duì)照組 2 302.52±111.30 19.19±0.93 17.5±4.25 45.58±15.6±5.27 52.32±15.31

表3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab 3 The comparison of open field test of different groups(±s，n=10)

表3 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較(±s，n=10)Tab 3 The comparison of open field test of different groups(±s，n=10)

a與對(duì)照組比較，P＜0.05

組 別 運(yùn)動(dòng)總路程/cm 中央?yún)^(qū)域時(shí)間/s 邊緣區(qū)域時(shí)間/s 運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間.58±13.07 0.13 μg·kg－1MC-LR 組 3 537.43±672.36 16.82±5.17 276.42±24.87 146.40±11.91 0.5 μg·kg－1MC-LR 組 3 505.47±758.74 18.54±8.45 269.26±15.63 145.19±12.47 2.0 μg·kg－1MC-LR 組 3 708.90±547.29a 12.50±6.17a 287.24±9.94a 152.32±15.31/s對(duì)照組 3 223.42±424.01 23.64±9.75 254.02±24.74 145 a

2.4 各組大鼠BBB通透性的變化

對(duì)照組和3個(gè)劑量MC-LR組大鼠通過(guò)BBB的EB含量依次為(2.12± 0.32)、(2.88±0.87)、(3.16±0.63)、(3.40 ±1.10)μg·g－1，顯示隨著染毒劑量的增加，腦組織EB含量逐步增加，高劑量MC-LR組的EB含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討 論

研究表明，大鼠經(jīng)口腔灌注或者腹腔注射MC-LR后在其大腦中發(fā)現(xiàn)MC-LR的蓄積[7]。藍(lán)藻提取物定位注射入大鼠腦內(nèi)，觀察到大鼠的空間學(xué)習(xí)能力有所降低[8];當(dāng)暴露濃度≥10 μg·L－1時(shí)，MC-LR 可以導(dǎo)致秀麗線蟲頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率顯著降低[9]。這些研究初步證實(shí)了MCs有可能進(jìn)入大腦造成神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損傷。

神經(jīng)毒物導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶等方面的功能障礙，是一個(gè)慢性病理過(guò)程。定向航行實(shí)驗(yàn)所形成的記憶屬于陳述性記憶，其儲(chǔ)存的機(jī)制涉及海馬和大腦皮層有關(guān)腦區(qū)[10]。而丘腦和海馬結(jié)構(gòu)則在空間工作記憶中起重要作用。在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，未觀察到MC-LR各劑量組和對(duì)照組之間的明顯差別，說(shuō)明MC-LR并未對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力造成損傷。李曉波等同樣采用大鼠灌胃染毒方式，60 d后的水迷宮實(shí)驗(yàn)也尚未證明MC-LR對(duì)大鼠空間記憶能力產(chǎn)生影響[11]。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)大鼠在新異環(huán)境下自發(fā)、探究行為與緊張度的一種方法。而對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)也可判斷大鼠認(rèn)知能力[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MC-LR 20 μg·kg－1劑量組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間明顯減少，在邊緣區(qū)域的行為增多，說(shuō)明大鼠的探索行為受到抑制;大鼠的總運(yùn)動(dòng)路程和運(yùn)動(dòng)行為的持續(xù)時(shí)間明顯增加。此結(jié)果與空間探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，表明MC-LR可以增加大鼠在進(jìn)入暗箱以及搜尋平臺(tái)過(guò)程中的緊張度。

BBB由腦內(nèi)毛細(xì)血管的內(nèi)皮和內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接、基膜以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突起構(gòu)成，可以阻止一些具有神經(jīng)毒性的物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)。有研究表明，MC-LR可由OATP1A2介導(dǎo)跨越BBB，轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦[5]，F(xiàn)eurstein等[13]的研究結(jié)果證明至少有5種mOatps參與原代全腦細(xì)胞在mRNA水平的表達(dá)。最近，Daniel等[14]進(jìn)一步在小鼠神經(jīng)元細(xì)胞體系中證實(shí)了有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽在MC-LR透過(guò)BBB進(jìn)入腦組織過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但尚無(wú)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)表明MC-LR可以造成BBB的損傷。EB是小分子指示劑，與血漿蛋白結(jié)合后不通過(guò)BBB，只有當(dāng)BBB被破壞、通透性增加時(shí)才進(jìn)入腦組織。本研究采用EB作為示蹤劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MC-LR 20 μg·kg－1劑量組腦組織中 EB 含量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明MC-LR可以引起B(yǎng)BB通透性的增加，與Cazenave等[15]實(shí)驗(yàn)結(jié)果的推論相符。

本研究顯示，MC-LR增加了大鼠的BBB通透性，并且改變了大鼠的探究行為能力和緊張度，相關(guān)的神經(jīng)損傷機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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