吡唑化合物 pyr3 干預對壓力負荷誘導的大鼠左心室肥厚的影響

田小芍 ,陳明 ,劉春霞

吡唑化合物 pyr3 干預對壓力負荷誘導的大鼠左心室肥厚的影響

田小芍 ,陳明 ,劉春霞

目 的：探 討 瞬 時 受 體 電 位 通 道 C 亞 族 3 亞 型（TRPC3） 的 選 擇 性 阻 滯 劑 吡 唑 化 合 物 Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate（pyr3）的體內(nèi)干預對壓力負荷大鼠左心室肥厚（LVH）程度的影響。

Ethyl-1-(4-(2,3,3-trichloroacrylamide)phenyl)-5-(trifluoromethyl)-1H-pyrazole-4-carboxylate ；壓力負荷；左心室肥厚；瞬時受體電位通道C亞族3亞型；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:226.)

阻止和逆轉(zhuǎn)左心室肥厚 (LVH)一直是心血管病研究的熱點和難點。從 LVH形成機制的研究中尋找有效藥理學靶點可能是阻止和逆轉(zhuǎn) LVH 的重要及可能有效途徑。瞬時受體電位通道C亞族3亞型（TRPC3）是細胞膜上非電壓依賴的 Ca2+通道。研究顯示， TRPC3 在 LVH 形成過程中起重要作用。TRPC3 基因顯性失活或體外細胞培養(yǎng)運用 TRPC3 通道阻滯劑均證實能夠有效減弱神經(jīng)內(nèi)分泌和壓力負荷誘導的LVH[1,2]，但目前相關 TRPC3 阻滯劑的體內(nèi)研究甚少。為此，本研究運用 TRPC3 的選擇性阻滯劑 pyr3，探討其體內(nèi)干預對壓力負荷大鼠LVH程度的影響。

1 材料與方法

材 料： 實 驗 的起止 時 間 為 2011-11 至 2012-09。實驗動物：8 周齡雄性 SD 大鼠 40 只（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心）。主要試劑、儀器：pyr3（美國Sigma 公司 ）；核糖核酸（RNA）提取試劑盒 Trizol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、脫氧核糖核酸（DNA）標記（寶生物工程大連有限公司）；山羊抗 TRPC3 抗體（英國 Abcam 公司）；兔抗鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 抗體（美國 Epitomic 公司 ）；凝膠成像系統(tǒng)和聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國 BIO-RAD 公司）。

方法：建立模型及實驗分組 40 只 8 周齡 SD 大鼠，編號并隨機抽出 27 只行腹主動脈縮窄術[3]，術后第 6天，存活的 18 只重新編號并隨機分為 3 組（n=6）：手術對照組：僅行腹主動脈縮窄術；手術后全程給藥組：術后第6天至第6周末給藥的；手術后后期給藥組：手術后第5周始到第6周末給藥的。另13只行假手術[3]，手術后第 6 天，存活的 12 只編號并隨機分為兩組（n=6）：假手術對照組(只行腹主動脈剝離，但不做縮窄手術 )；假手術后全程給藥組：假手術后第 6 天至第6周末給藥的。術后第6天，5組30只大鼠中的各給藥組按要求開始每天腹腔注射 pyr3（ 0.1 mg/kg）[4]，對照組給予用雙蒸水稀釋至 2%的二甲亞砜（1 ml/kg）。

左心室質(zhì)量指數(shù)的檢測：5 組共 30 只大鼠術后6周末稱重后處死，迅速取出心臟，低溫下剪取左心室和室間隔并稱重，計算左心室質(zhì)量指數(shù)。

左心室心肌細胞橫徑的測量：采用 HE 染色，高倍鏡采集圖片，用 IPP 6.0 軟件在每張圖片中隨機選取20個胞漿清晰、胞核完整的心肌細胞，經(jīng)核處測量其橫徑，取均值。

左心 室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ mRNA表達的測定：Trizol提取總核糖核酸（RNA），反轉(zhuǎn)錄生成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。擴增引物序列： TRPC3（461bp）F:5'-ttcatggttctcttcatcatgg-3'，R: 5'-aagtcttctcctcctgcatttg-3'； 鈣 調(diào) 神 經(jīng) 磷 酸 酶Aβ（265bp）F:5'-ttctcagggaggagagtgaaag-3'，R:5'-gtgttcagggaattgaaaccat-3'；磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH) F:5'acagcaacagggtggtggac-3'，R:5'tttgagggtgcagcgaactt-3'；β- 肌 動 蛋 白 (β-actin)F:5'-ccacgaaactaccttcaactcc-3'，R:5'-gtgatctccttctgcatcctgt-3'。 擴 增 TRPC3 基 因 的 PCR條件：94℃預變性 3 min，94 ℃變性 30 s，61℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共擴增 35 個循環(huán)，于 72 ℃再延伸5 min。擴增鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ、GAPDH 及 β-actin基因的退火溫度為 58 ℃、60 ℃和 60 ℃，均擴增 30個循環(huán)，余同 TRPC3 基因的擴增。擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳。Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行光密度分析，測定以上指標信使核糖核酸（mRNA）相對含量。

左心室 TRPC3 蛋白免疫組織化學染色：按文獻方法[5]對各組左心室心肌組織進行包埋、切片及TRPC3 蛋白免疫組織化學染色。用 IPP6.0 圖像分析軟件分析結果。

左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白免疫印跡：提取左心室心肌細胞膜蛋白并定量，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（TRPC3、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 為 1:2000，β-actin 為 1:1000）和二抗。顯色后用 Quantity One 采集圖像，β-actin 為內(nèi)參分析光密度，測定各樣本目的蛋白相對含量。

統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)應用 SPSS Statistics V17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用方差分析，各組兩兩比較用 Bon ferron i法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較 ：圖1、2 為各組大鼠心肌組織橫切面 HE 染色。手術對照組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑顯著高于假手術對照組；手術后全程給藥組和手術后后期給藥組上述兩個指標較手術對照組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。假手術后全程給藥組與假手術對照組間兩個指標差異無統(tǒng)計學意義。表1

表1 各組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較

表1 各組左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑的比較

注：與假手術對照組比*P ＜ 0.05 與手術對照組比?P ＜ 0.05

組別 左心室質(zhì)量指數(shù)（m g / g）左心室心肌細胞橫徑( μ m )假手術對照組 1 . 9 1 ± 0 . 5 9 1 4 . 0 3 ± 0 . 1 7手術對照組 3 . 1 0 ± 0 . 2 7* 2 0 . 4 1 ± 0 . 7 9*假手術后全程給藥組 1 . 9 2 ± 0 . 0 5 1 4 . 1 5 ± 0 . 2 7手術后后期給藥組 2 . 8 3 ± 0 . 2 3? 1 8 . 6 3 ± 0 . 6 0?手術后全程給藥組 2 . 4 6 ± 0 . 1 1? 1 5 . 9 5 ± 0 . 3 9?

圖1 各組大 鼠心臟橫切面 HE 染色 圖2 各組大鼠左心室心肌組織橫切面 HE 染色 圖3 各組大鼠左心室心肌組織 TRPC3 免疫組織化學染色 A：假手術對照組 B：手術對照組 C：假手術后全程給藥組 D：手術后后期給藥組 E：手術后全程給藥組。TRPC3：瞬時受體電位通道 C 亞族 3 亞型 箭頭所指為陽性顆粒

TRPC3 的免疫組織化學染色結果：如圖3 所示，棕黃色顆粒為 TRPC3 陽性表達。IPP6.0 軟件分析光密度示，手術對照組和假手術后全程給藥組 TRPC3表達顯著高于假手術對照組；手術后全程給藥組TRPC3 表達較手術對照組顯著減少，上述差異均有統(tǒng)計學意義（P 均 ＜ 0.05）。

TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 AβmRNA 的表達：如圖4、5示，手術對照組和假手術后全程給藥組TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ的 mRNA 表達均顯著高于假手術對照組；手術后全程給藥組上述兩個指標均顯著低于手術對照組；手術后后期給藥組鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 AβmRNA 的表達較手術對照組降低，上述比較的差異均有統(tǒng)計學意義（P 均 ＜ 0.05），而手術后后期給藥組 TRPC3 的 mRNA 表達較手術對照組未見顯著減少（P＞0.05）。

TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 的免疫印跡結果： 如圖6、7 所示，手術對照組和假手術后全程給藥組左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白表達量顯著高于假手術對照組；手術后后期給藥組和手術后全程給藥組與手術對照組相比，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 表達均有顯著下降，而 TRPC3 的蛋白表達只有手術后全程給藥組顯著降低，上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。

圖4 TRPC3 和 CaN Aβ 基因 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 圖5 各組 TRPC3 和 CaN Aβ mRNA 表達的相對含量結果的比較 與假手術對照組比較*P＜0.05 與手術對照組比較?P＜0.05 TRPC3：瞬時受體電位通道 C亞族 3 亞型 GAPDH：磷酸 甘油醛脫氫酶 CaN Aβ：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ mRNA：信使核糖核酸 M：分子量 Marker 余注見圖1

圖6 各組 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表達的蛋白免疫印跡結果 圖7 各組 TRPC3 和 CaN Aβ 蛋白表達相對含量結果的比較 與假手術對照組比較*P ＜ 0.05 與手術對照組比較?P ＜ 0.05。 余注見圖1

3 討論

pyr3 能有效阻斷 TRPC3 相關的鈣庫操縱性鈣離子內(nèi)流[6]，減少肥厚因子心房鈉尿肽、腦鈉肽基因表達[7，8]。日本學者首次指出在體應用 pyr3（0.1mg/kg per day）可以減弱小鼠壓力負荷誘導的心肌肥厚[4]。但目前，相關動物體內(nèi)試驗研究報道甚少，結果有待明確。

本研究運用腹主動脈縮窄建立大鼠壓力負荷模型，模擬 TRPC 通道激活條件。腹主動脈縮窄手術急性期后即給予 pyr3 直到術后 6 周末，不僅顯著減弱了大鼠壓力負荷刺激下左心室肥厚的程度，同時也使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 蛋白和 mRNA的表達明顯下調(diào)。據(jù)我們所知，這是較早在SD大鼠體內(nèi)給予 TRPC 通道阻滯劑的實驗研究，這一結果有重要的理論意義和潛在的臨床價值。

術后第5周開始給藥至第6周末的大鼠，雖然左心室肥厚程度及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和mRNA 表達也有一定程度的下降，但是 TRPC3 的蛋白和mRNA表達無明顯變化。這可能是由于一種涉及 TRPC 通道和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T 細胞核因子信號通路的激活之間的正反饋調(diào)節(jié)機制。Bush 等[9]提出 TRPC 通過一種正反饋調(diào)節(jié)機制促使了心臟肥大增生。病理的壓力刺激導致了磷脂酶C的激活和胞內(nèi) Ca2+庫的排空，這可能使 TRPC 通道激活并產(chǎn)生一個足以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化的T細胞核因子信號通路的 Ca2+信號。TRPC3 自身基因表達也受鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化的T細胞核因子信號通路的調(diào)控，他們形成一種正反饋調(diào)節(jié)使心臟中肥大基因的表達處于一個穩(wěn)定的狀態(tài)。也有學者指出 TRPC3 參與調(diào)節(jié)心肌細胞中的鈣庫操縱性鈣離子內(nèi)流，阻止其活性能夠減弱神經(jīng)激素刺激導致的心房鈉尿肽的表達和心肌細胞體積的增大，而肥厚心肌細胞中 TRPC3的過表達在心肌肥大的過程中能通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T 細胞核因子信號通路得以放大[10]。而腹主動脈縮窄術后第5周才開始給藥可能是由于此時心肌肥厚已經(jīng)形成，壓力負荷下 TRPC3 的表達已經(jīng)明顯上調(diào)，因此藥物干預對肥厚的阻止和逆轉(zhuǎn)效果不明顯，TRPC3 基因和蛋白表達較手術不給藥也無明顯降低，這也可能和給予 pyr3 時間過短有關，推測如果更長時間地給予 pyr3，已經(jīng)肥厚的心肌可能逆轉(zhuǎn)，有待進一步研究。

作為對照，大鼠假手術急性期后同樣用 pyr3 進行干預，發(fā)現(xiàn) pyr3 對假手術大鼠左心室心肌細胞大小無影響，而使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 和 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表達上調(diào)。這可能是由于生理性的TRPC3 活性被阻滯后，心肌細胞內(nèi) Ca2+減少，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性減弱，從而通過負反饋作用上調(diào)TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因和蛋白的表達來實現(xiàn)正常生理需要下 TRPC3 對 Ca2+及調(diào)神經(jīng)磷酸酶對肥厚相關通路的調(diào)控。有關TRPC3和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 /活化的 T細胞核因子信號通路間正負反饋機制非常復雜，仍待深入研究和明確。但是本研究初步證實 TRPC3 選擇性阻滯劑 pyr3 較長時間體內(nèi)干預對高血壓左心室肥厚的阻止和初步逆轉(zhuǎn)作用，提示pyr3 或其同類藥物可能成為日后心血管臨床逆轉(zhuǎn)壓力負荷導致的 LVH的新藥，值得深入研究。

[1]Wu X, Eder P, Chang B, et al. TRPC channels are necessary mediators of pathologic cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107:7000-7005.

[2]Nakayama H, Wilkin BJ, Bodi I, et al. Calcineurin-dependent cardiomyopathy is activated by TRPC in the adult mouse heart. FASEB J, 2006, 20:1660-1670.

[3]張淑華，王云霞，張娜，等 .纈沙坦、氨氯地平及螺內(nèi)酯聯(lián)合應用對大鼠腹主動脈部分縮窄引起心肌肥厚的影響 .中國循環(huán)雜志，2012，27：383-386.

[4]Kiyonaka S, Kato K, Nishida M, et al. Selective and direct inhibition of TRPC3 channels underlies biological activities of a pyrazole compound. Proc Natl Acad Sci, 2009, 106: 5400-5405.

[5]廖雪艷， 陳 明， 余冬梅 .不 同 降 壓 藥 物 干 預對自發(fā)性高血壓大鼠主動脈瞬時受體電位通道 C亞族表達的影響.中國循環(huán)雜志，2011，26：65-68.

[6]Kiyonaka S, Kato K, Nishida M. et al. Pharmacological properties of novel TRPC channel inhibitors. Yakugaku Zasshi, 2010, 130:303-311.

[7]Klaiber M, Dankworth B, Kruse M, et al. A cardiac pathway of cyclic GMP-independent signaling of guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108:18500-18505.

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[9]Bush EW, Hood DB, Papst PJ, et al. Canonical transient receptor potential channels promote cardiomyocyte hypertrophy through activation of calcineurin signaling. J Biol Chem, 2006, 281: 33487-33496.

[10]Guinamard R, Bois P. Involvement of transient receptor potential proteins in cardiac hypertrophy.Biochim Biophys Acta, 2007,1772:885-894.

Effect of Pyrazol Chemical Compound pyr3 on Pressure Overloaded Rats for Their Left Ventricular Hypertrophy

Tian Xiao-shao, CHEN Ming, LIU Chun-xia.

Department of Cardiology, Chongqing Medical University First Affiliated Hospital, Chongqing (400016), China Corresponding Author: CHEN Ming, Email: chenmingcq@126.com

Objective: To study the effect of a pyrazol chemical compound, pyr3, the selective blocker of transient receptor potential canonical 3 (TRPC3) on pressure overloaded rats for their left ventricular hypertrophy (LVH）in vivo.Methods: The pressure overloaded rats model was established by abdominal aortic constriction. 30 male SD rats With weight of 200～240g were randomly divided into 5 groups: ① Sham operation group, ② Operation control group, ③ Sham operation with whole-course medication group, ④ Operation with later medication group and ⑤ Operation with wholecourse medication group. n=6 in each group and all rats were treated for 6 weeks. The left ventricular mass index (LVMI) and left ventricular myocardial transaction diameter (LVMTD) were calculated; the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were examined by RT-PCR, Western blot analysis and immunohistochemistry respectively.Results: Compared with Sham operation group, Operation control group presented the increased LVMI, LVMTD, higher mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ. In Sham operation with whole-course medication group, the left ventricular hypertrophy related indexes were no real changes while the mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were obviously increased, all P＜0.05. Compared with Operation control group, Operation with whole-course medication groupshowed decreased hypertrophy related indexes and decreased mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ,all P＜0.05. In Operation with later medication group, the hypertrophy related indexes and mRNA and protein expressions of TRPC3 and calcineurin Aβ were decreased, all P＜0.05, while TRPC3 mRNA and protein expression was similar.Conclusion: pyr3 treatment may prevent pressure overloaded rats for their LVH at certain point, and decrease the upregulation of TRPC3 and calcineurin Aβ .

pyr3; Pressure overloaded; Left ventricular hypertrophy; Transient receptor potential canonical 3; Calcineurin Aβ

2012-12-18）

（助理編輯：曹洪紅）

400016 重慶市，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科

田小芍 碩士研究生 主要從事高血壓的發(fā)病機制研究及防治 Email：lmtpershao@163.com 通訊作者：陳明 Email：chenmingcq@126.com

R541

A

1000-3614（2013）03-0226-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.03.019

方法：采用腹主動脈縮窄手術建立左心壓力負荷模型。30 只 200～240g 雄性 SD 大鼠隨機分為五組 (n=6)：假手術對照組、手術對照組、假手術后全程給藥組、手術后后期給藥組，手術后全程給藥組。6周后，計算各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)、左心室心肌細胞橫徑，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶連反應（RT-PCR）、免疫組織化學和蛋白免疫印跡檢測 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 信使核糖核酸（mRNA）和蛋白的表達水平。

結果：與假手術對照組相比，手術對照組左心室肥厚相關指標 (左心室質(zhì)量指數(shù)和左心室心肌細胞橫徑 )及TRPC3、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ蛋白和mRNA的表達顯著升高；假手術后全程給藥組左心室肥厚相關指標無顯著變化，而 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白及 mRNA 的表達量顯著升高 ,差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜ 0.05）。與手術對照組比較，手術后全程給藥組左心室肥厚相關指標、TRPC3及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 表達均明顯降低（P 均＜ 0.05）；手術后后期給藥組左心室肥厚相關指標及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 Aβ 蛋白和 mRNA 的表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜ 0.05），而 TRPC3 的蛋白和 mRNA 表達未見顯著降低。

結論：pyr3 體內(nèi)干預能夠一定程度上阻止壓力負荷導致的大鼠左心室肥厚，降低壓力負荷大鼠左心室 TRPC3 和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Aβ表達的上調(diào)。