以適體作為載體介導(dǎo)siRNA 靶向運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展

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以適體作為載體介導(dǎo)siRNA 靶向運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展

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小干擾RNA（siRNA）通過(guò)RNAi途徑沉默目的基因，因此其在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用受到關(guān)注。如今siRNA作為藥物應(yīng)用于治療的主要問(wèn)題是如何將siRNA靶向傳遞到目標(biāo)細(xì)胞或組織。適體是一種體外合成的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，由于對(duì)靶分子有高特異性、穿透力強(qiáng)、低免疫原性等特點(diǎn)，適體可作為載體用于藥物的靶向運(yùn)輸。本文主要介紹用適體介導(dǎo)siRNA靶向傳遞的研究進(jìn)展。

適體；siRNA；RNA干擾；靶向傳遞

隨著近些年科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因治療、個(gè)體化醫(yī)療等逐漸成為討論的熱點(diǎn)。小干擾RNA（smallinterference RNA，siRNA）通過(guò)RNA干擾途徑抑制靶基因的表達(dá)；而適體具有高親和力、高特異性、穿透力強(qiáng)、分子量小等特點(diǎn)。二者同時(shí)皆是小分子核酸，免疫原性低，因此適體介導(dǎo)的siRNA干擾技術(shù)是一種靶向性強(qiáng)，副作用小的治療策略。

1 siRNA及其靶向運(yùn)輸載體

siRNA是長(zhǎng)約21～25 nt的雙鏈小分子RNA。siRNA通過(guò)RNA干擾（RNAi）途徑能夠使特定基因沉默或者表達(dá)水平降低[1]，從而阻斷某種特定蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此siRNA具有成為新型核酸藥物的潛力。目前siRNA類(lèi)藥物的研究已在多種疾病治療領(lǐng)域取得了較大的進(jìn)展。如今應(yīng)用這種新藥所面臨的難題主要是如何使siRNA安全并穩(wěn)定地傳送到病變的靶細(xì)胞或靶組織中去。

經(jīng)過(guò)多年的研究，已找到幾種siRNA體內(nèi)運(yùn)輸載體。有乳糖化脂質(zhì)體[2]、膽固醇[3]、維生素E[4]、多肽[5]、由陽(yáng)離子脂質(zhì)構(gòu)成的納米顆粒[6]以及抗體[7]和適體等。其中，乳糖化的脂質(zhì)體、膽固醇以及維生素E等可作為肝臟靶向載體，與siRNA結(jié)合，能有效地提高肝臟對(duì)siRNA的攝取[2,4]。但是這些載體不是針對(duì)某種特定的細(xì)胞，靶向性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如抗體和適體?？贵w和適體可以既是載體又是靶標(biāo)分子的配體?？贵w由于具有高特異性，被認(rèn)為是一種理想的送藥載體。但是抗體是一類(lèi)大分子蛋白，具有潛在的免疫原性，進(jìn)入機(jī)體后可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，有一定的毒副作用，限制了抗體在這方面的應(yīng)用。適體被稱(chēng)為是核酸形式的抗體，與抗體一樣，適體同樣具有對(duì)靶標(biāo)分子的高特異性，但其分子量小，穿透力強(qiáng)，不存在明顯的免疫原性，所以作為靶向載體比抗體更安全。

2 靶向載體：適體

適體是通過(guò)體外合成的一種單鏈DNA或RNA寡核苷酸，經(jīng)體外指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選得到[8]。近幾年來(lái)，適體技術(shù)發(fā)展迅速，已有許多不同的蛋白或者細(xì)胞的適體經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到?，F(xiàn)今，適體作為靶向載體的研究日益受到關(guān)注。

適體一般由19～80個(gè)堿基構(gòu)成，分子量為6～25 kDa。作為載體，適體具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：第一，高特異性和高親和力。由于適體可折疊成獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而具有特異、穩(wěn)定的立體構(gòu)象，所以適體對(duì)其靶標(biāo)具有高特異性以及高親和力[8]，其特異性甚至高于抗體。第二，穿透性強(qiáng)，免疫原性低。適體是一種小分子物質(zhì)，更有利于其穿透組織或細(xì)胞，同時(shí)，適體無(wú)明顯免疫原性，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒副作用，用藥更安全。第三，適體易于合成和修飾。如今適體已成功介導(dǎo)一些藥物在體外和體內(nèi)的靶向傳遞，這些藥物除了siRNA[15,18～21,30]，還包括抗癌藥[9～10]、毒素[11]、酶[12]、放射性核素[13]以及病毒[14]等等。

3 適體介導(dǎo)的siRNA傳遞

用適體介導(dǎo)siRNA傳遞，需要適體除了能特異性地與目的細(xì)胞上的靶分子結(jié)合，還能夠引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞。如今已有研究發(fā)現(xiàn)，幾種靶標(biāo)分子的適體可進(jìn)入表達(dá)該分子的細(xì)胞中。這些靶標(biāo)有PSMA[22]、CD4[23]、HIV糖蛋白gp120[18]、細(xì)胞粘合素C（TN-C）[24]、蛋白酪氨酸酶（PTK7）[25]、鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）[12]、核仁素（NCL）[9]以及粘蛋白1（MUC1）[10]等等。近幾年來(lái)，多個(gè)小組對(duì)此進(jìn)行了研究，利用針對(duì)CD30、CD4，PSMA、gp120等靶標(biāo)的適體成功介導(dǎo)siRNA完成RNA干擾。最近的報(bào)道還介紹了針對(duì)B細(xì)胞激活因子受體（B cell activating factor-receptor，BAFF-R），以一段序列與siRNA相連，成功沉默了靶細(xì)胞的STAT3基因的表達(dá)[30]。

3.1 CD30適體介導(dǎo)的siRNA傳遞

CD30在間變性大細(xì)胞性淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）細(xì)胞表面特異性表達(dá)。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因是ALCL細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)的癌基因。Zhao等[6]用聚乙烯亞胺（PEI）和檸檬酸鹽構(gòu)成一個(gè)納米內(nèi)核，CD30的特異性核酸適體與目的基因?yàn)锳LK的siRNA分別結(jié)合于PEI納米內(nèi)核的表面，形成一個(gè)納米復(fù)合物。其中，PEI是一種陽(yáng)離子聚合物，具有高轉(zhuǎn)染效率，緩沖能力強(qiáng)，易于將核酸分子從核內(nèi)體釋放出來(lái)等優(yōu)點(diǎn)，是一類(lèi)理想的傳遞siRNA的載體。實(shí)驗(yàn)證明，納米復(fù)合物能特異地使ALCL細(xì)胞的ALK基因的表達(dá)降低。通過(guò)這種設(shè)計(jì)可以將不同的siRNA或者藥物通過(guò)納米復(fù)合物的形式作用于腫瘤細(xì)胞，起到協(xié)同治療的作用。因此，這種納米復(fù)合物具有臨床應(yīng)用前景。

3.2 PSMA適體介導(dǎo)的siRNA傳遞

前列腺特異性膜抗原（prostate-speci fi c membrane antigen，PSMA）在原發(fā)性或者轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常的前列腺上皮細(xì)胞中不表達(dá)。PSMA是一種跨膜蛋白，可被內(nèi)吞入細(xì)胞。Lupold等[22]用隨機(jī)RNA庫(kù)，以修飾后的胞外形式的PSMA為靶標(biāo)，篩選出兩種適體，A9和A10。已有報(bào)道證明這2種適體都可進(jìn)入細(xì)胞，有研究利用這兩種適體介導(dǎo)化療藥物、包被藥物的納米顆粒、毒素和siRNA等的靶向傳遞[11,15,16,26]。

Chu等[20]于2006年報(bào)道將靶標(biāo)為PSMA的適體A9生物素化，而后分別與生物素化了的目的基因?yàn)锳/C或GAPDH這兩種基因的siRNA通過(guò)生物素和鏈霉親和素之間的作用力結(jié)合，形成復(fù)合物。為了使得siRNA在進(jìn)入細(xì)胞后更容易脫離出來(lái)，適體和siRNA之間以二硫鍵相連，當(dāng)復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境，可使二硫鍵斷裂，從而使siRNA解離。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，這個(gè)適體-生物素-鏈霉親和素-生物素-siRNA復(fù)合物成功沉默了表達(dá)PSMA的LNCap細(xì)胞中A/C以及GAPDH基因的表達(dá)，而對(duì)PSMA陰性細(xì)胞PC3不產(chǎn)生明顯的影響。這種方法雖然用適體成功將siRNA帶入靶細(xì)胞，并沉默目的基因，但是鏈酶親和素是大分子量的蛋白，進(jìn)入機(jī)體后可能會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生毒副作用。所以目前還無(wú)法應(yīng)用于臨床治療。

McNamara等[16]找到另一種siRNA與適體的結(jié)合方式，即是直接將針對(duì)PSMA的適體A10與siRNA的正義鏈一起化學(xué)合成，形成長(zhǎng)鏈，再將siRNA的反義鏈與長(zhǎng)鏈中的siRNA正義鏈雜交，如此，通過(guò)共價(jià)鍵的形式相連形成嵌合體。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該嵌合體能特異地沉默LNCap細(xì)胞中的PLK1與BCL2基因。并且還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將嵌合體直接注射入裸鼠攜帶的LNCap腫瘤中，腫瘤體積明顯減小，而PC3腫瘤未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了通過(guò)適體-siRNA結(jié)合體的連接方式，可成功介導(dǎo)siRNA靶向傳遞。這種嵌合體的成分只是RNA，具有免疫原性低，易于合成與修飾等優(yōu)點(diǎn)，有利于在體內(nèi)用藥。

在此基礎(chǔ)上，該研究小組對(duì)此嵌合體進(jìn)一步優(yōu)化[15]。首先，他們將PSMA-siRNA嵌合體的適體部分A10由原來(lái)的71 nt變?yōu)?9 nt（A10-3.2），這樣不僅大大降低核酸合成的成本而且簡(jiǎn)化了合成工序,有利于大規(guī)模的化學(xué)合成。第二步，在嵌合體長(zhǎng)鏈的3'端加了2個(gè)尿嘧啶核苷酸尾（UU），這樣有利于細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶DICER的識(shí)別。第三步，將siRNA部分的正義鏈和反義鏈位置交換，并在正義鏈（即短鏈）上加20 kDa的聚乙二醇（PEG），這樣更有利于正確介導(dǎo)反義鏈進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）。除此之外，20 kDa PEG使嵌合體的半衰期明顯延長(zhǎng),從而大大提高siRNA的沉默效率。由此，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已驗(yàn)證得出優(yōu)化后的結(jié)合體沉默效率提高了100倍。同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中又證明了通過(guò)全身用藥（腹腔注射）可使得腫瘤體積明顯減小，并且優(yōu)化后的嵌合體藥效更持久。

為了提高適體介導(dǎo)的siRNA靶向傳入細(xì)胞的效率，有研究將多個(gè)適體與siRNA相連。Wullner等[21]設(shè)計(jì)了兩種由二價(jià)PSMA適體和siRNA構(gòu)成的嵌合體。一種是把siRNA自身作為連接兩個(gè)適體的連接體，另一種是將siRNA分別于兩個(gè)適體的3'端。結(jié)果顯示，與單價(jià)的適體-siRNA相比，具有二價(jià)適體的嵌合體由于進(jìn)入靶細(xì)胞的能力增強(qiáng)，因而提高了嵌合體對(duì)目的基因EEF2的沉默效率。

3.3 CD4適體介導(dǎo)的siRNA傳遞

CD4是在T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的一種糖蛋白。是HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要受體。Th細(xì)胞過(guò)表達(dá)的CD4蛋白可被內(nèi)吞入細(xì)胞。Guo等[19]在2005年設(shè)計(jì)了一種利用噬菌體pRNA（packing RNA）將靶標(biāo)為CD4的適體與siRNA結(jié)合的方法。pRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有5'/3'環(huán)狀結(jié)構(gòu)（L環(huán)與R環(huán)），兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)之間存在互補(bǔ)區(qū)域。將siRNA和適體分別與噬菌體pRNA相連，而后通過(guò)pRNA的環(huán)-環(huán)之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)，siRNA與適體結(jié)合，形成二聚體。實(shí)驗(yàn)證明，這個(gè)二聚體可進(jìn)入CD4（+）T淋巴細(xì)胞，并且成功沉默了目的基因。

最近，Zhu等[29]將CD4的RNA適體轉(zhuǎn)變成DNA，二者被證明有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。將DNA形式的適體與siRNA直接化學(xué)合成，形成嵌合體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該DNA形式的適體具備與RNA適體相似的高親和性和特異性，并成功介導(dǎo)了siRNA進(jìn)入表達(dá)CD4的T細(xì)胞。

3.4 gp120適體介導(dǎo)的siRNA傳遞

gp120蛋白是HIV-1表面的囊膜蛋白，是一種糖蛋白，在HIV病毒與宿主細(xì)胞融合的過(guò)程中起著重要作用，當(dāng)gp120與T細(xì)胞膜表面的CD4結(jié)合后，引發(fā)HIV-1進(jìn)入細(xì)胞[27]。已有研究證明，gp120蛋白的適體能與HIV-1 gp120結(jié)合并且進(jìn)入細(xì)胞，因此，gp120適體也是能夠攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞的載體。Zhou等[17]將gp120適體與沉默HIV-1tat/rev基因的siRNA共價(jià)合成，為了降低空間位阻的影響，適體和siRNA之間存在一個(gè)4 nt的銜接子（linker）。由于gp120適體具有阻止HIV感染宿主細(xì)胞的功能，而siRNA又可通過(guò)RNA干擾途徑沉默目的基因HIV-1tat/rev，所以這種嵌合體具有雙重抗病毒作用。

Zhou等[28]設(shè)計(jì)了一種富含GC的“粘性寡核苷酸橋”。即是在適體的3'端通過(guò)化學(xué)合成，加上富含GC的一段寡核苷酸鏈。同時(shí)在siRNA的3'端加上與之互補(bǔ)的一段寡核苷酸鏈。二者通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)相連。這種設(shè)計(jì)可以增加結(jié)合體的靈活性，不影響適體與siRNA各自的結(jié)構(gòu)，并且在不影響適體結(jié)合細(xì)胞功能的前提下，使不同的siRNA與適體相連。除此之外，通過(guò)這種設(shè)計(jì)方法，將來(lái)可能擴(kuò)展到把多個(gè)siRNA與一個(gè)適體相連，成為一種具有多重效應(yīng)的多價(jià)嵌合體。

4 面臨的問(wèn)題與展望

用適體作為載體介導(dǎo)siRNA傳遞技術(shù)無(wú)疑為許多疾病的治療提供新的治療策略。但此技術(shù)目前還不成熟，其應(yīng)用于臨床主要面臨如下幾大問(wèn)題：第一，一些復(fù)合物/嵌合體進(jìn)入體內(nèi)后可能會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，存在潛在的危險(xiǎn)性，所以要通過(guò)一些修飾優(yōu)化或找到一種新的安全的載體來(lái)降低或者除去其免疫原性。第二，復(fù)合物/嵌合體在血清中會(huì)被核酸酶降解，因此要通過(guò)一些修飾來(lái)提高復(fù)合物/嵌合體的穩(wěn)定性。第三，如今通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出來(lái)的適體種類(lèi)、數(shù)量有限，因此適體介導(dǎo)siRNA傳遞這項(xiàng)技術(shù)就只能對(duì)少數(shù)相應(yīng)的幾種疾病有效，大大限制了適體-siRNA復(fù)合物/嵌合體在臨床上的應(yīng)用。因此需要在未來(lái)建立一種新的篩選技術(shù)或改進(jìn)現(xiàn)有的篩選技術(shù)以篩選出更多的針對(duì)不同靶標(biāo)的適體。第四，適體-siRNA嵌合體一般是通過(guò)化學(xué)合成相連，如今的核酸合成技術(shù)只適用于合成小規(guī)模的寡核苷酸，而長(zhǎng)鏈核酸的大規(guī)模、高質(zhì)量化學(xué)合成目前還難以達(dá)到。因此要經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析后，將適體-siRNA嵌合體在不影響其功能的前提下長(zhǎng)度盡量達(dá)到最短以簡(jiǎn)化合成工序并且節(jié)約成本。

5 總結(jié)

siRNA能通過(guò)RNA干擾途徑沉默目的基因，是一類(lèi)具有應(yīng)用前景的基因類(lèi)藥物。但是用siRNA治療疾病還存在靶向傳遞等問(wèn)題。適體由于其具有高特異性，高親和力等特點(diǎn)，是一種理想的介導(dǎo)siRNA靶向傳遞載體。但是，目前通過(guò)SELEX篩選技術(shù)得到的適體有限，需要在將來(lái)找到更有效的篩選技術(shù)篩選更多的適體，尤其是能夠進(jìn)入細(xì)胞的適體。除此之外，適體與siRNA如何相連也是研究的熱點(diǎn)。這里要考慮到適體與siRNA連接產(chǎn)物不會(huì)影響到適體和siRNA各自的功能，甚至是增強(qiáng)其各自的功能，并且在體內(nèi)給藥時(shí)不容易被降解，同時(shí)不會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)導(dǎo)致副作用等。如今，已有幾種連接方法在細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有明顯的治療效果，但依然存在許多問(wèn)題，需要從各方面優(yōu)化，以用于臨床。相信突破這些瓶頸，適體-siRNA復(fù)合物/嵌合體能廣泛用于臨床治療。

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Research progress on aptamers as vector mediated siRNA targeted delivery

ZHANG Shimeng1, LIU Fei2, ZHENG Lei1, WANG Qian1★
(1.Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.Clinical Laboratory, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangdong, Guangzhou 510623, China)

Small interfering RNA (siRNA) lead to gene silencing through RNA interference (RNAi) approach, which should be paid attention to the applicaion of disease treatment. Now the main problem about siRNA as drugs in disease treatment is how to transfer siRNA targeting to the target cell or tissue. Aptamer, a kind of single-stranded DNA or RNA oligonucleotides synthesized in vitro, has the characteristics of high speci fi city, strong penetrating, low immunogenicity, which can be used as vector for targeting delivery. This review mainly introduces the development of aptamer mediated siRNA delivery.

Aptamer; siRNA; RNA interference; Targeted delivery

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東，廣州 510515

2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗(yàn)部，廣東，廣州 510623

★通訊作者：王前，E-mail: wangqian@ fi mmu.com