早期肺癌動物模型的研究進展

肖時滿 綜述 強金偉 審校

肺癌發(fā)病率和死亡率居癌癥首位，目前肺癌的早期發(fā)現(xiàn)率和診斷率尚未有效提高，臨床就診的大部分肺癌患者為中晚期，治療效果差，生存時間很短。非小細胞肺癌的5年生存率僅為10%～15%，小細胞肺癌則僅約5%；而早期肺癌如原位癌、微浸潤癌的治愈率近100%，手術(shù)切除的I期肺癌生存率也可達90%以上[1]。因此，目前的研究者均主要關(guān)注早期肺癌的發(fā)生、發(fā)展機制及形態(tài)學(xué)和功能學(xué)變化特點，旨在充分理解其癌生物現(xiàn)象，找到診斷早期肺癌的特異性指標和征象，為早期干預(yù)、提高生存率奠定基礎(chǔ)。所以，構(gòu)建早期肺癌的動物模型對肺癌的研究顯得尤為重要。

一個理想的動物模型應(yīng)符合以下幾項要求：①動物容易獲得；②包含腫瘤發(fā)生、發(fā)展的全過程；③誘發(fā)機制與人類致癌因子的作用機制相同或相似；④操作容易，定位準確，重復(fù)性好，并且與劑量相關(guān)；⑤誘發(fā)的新生物組織類型與人類相似，盡可能再現(xiàn)所要求的人類疾?。虎匏钑r間短，成功率高，有利于臨床研究。

肺癌模型的動物種類

模型動物的選擇應(yīng)為結(jié)構(gòu)、機能、代謝與人類相似的動物。一般來說，動物進化階段越高，其結(jié)構(gòu)、功能越復(fù)雜，反應(yīng)也越接近于人類。目前，肺癌動物模型多選擇小鼠、大鼠、地鼠、兔、羊和狗等動物。

小鼠：小鼠是目前應(yīng)用最為廣泛的肺癌模型動物，也是肺腺癌的重要模型載體，可以誘發(fā)出包括小細胞肺癌在內(nèi)的各種組織學(xué)類型的肺癌。小鼠的肺癌在組織學(xué)、形態(tài)學(xué)、分子學(xué)特點上與人類肺癌比較接近，而小鼠與人類基因之間具有同源性，其基因容易操控[2]，所以小鼠模型在肺癌研究中應(yīng)用較多。但仍存在兩個問題：一是人類腫瘤在小鼠體內(nèi)生長相對較快，提示小鼠和人類對腫瘤的敏感性有顯著差異；二是小鼠肺癌具有散發(fā)性和異源性的特點[3]。但關(guān)于后者，人類也有相似點，如Madeline等[4]的研究發(fā)現(xiàn)高達18%的早期肺腺癌為多發(fā)性肺癌。

大鼠：大鼠是鱗癌的好發(fā)宿主，也可誘導(dǎo)出多種非小細胞型肺癌的組織學(xué)類型。但是目前學(xué)者們認為人類肺泡和下呼吸道的上皮組織是支氣管肺癌的好發(fā)部位，致癌物的吸收取決于氣道上皮的厚度以及與胞漿面積有關(guān)的核漿比，而大鼠的支氣管上皮厚度與人類有明顯的差異，因而誘發(fā)機制也可能不同，也被質(zhì)疑為非理想的動物模型[5]。

地鼠：地鼠原發(fā)性肺癌（主要為腺癌）的發(fā)生率很低，其支氣管結(jié)構(gòu)與人類相似，抗感染能力強，同時又具有與人類相似的經(jīng)鼻甲呼吸、過濾的功能，因而被認為是較好的肺癌研究模型，如敘利亞金黃地鼠對誘發(fā)肺癌較敏感[6]。但其個體較小，限制了在介入方面的應(yīng)用。

犬：犬的生活方式和生存環(huán)境比其它動物更接近于人類，機體反應(yīng)也更接近于人類，因此很適合于肺癌的研究，主要病理類型為非小細胞肺癌。犬的原發(fā)性肺癌與人類相似，尤其是其支氣管動脈更接近于人類，可用于影像學(xué)研究如X線、CT檢查等，以及應(yīng)用于介入治療、內(nèi)外科治療的研究，是較為理想的制備肺癌模型的實驗動物[7]。

兔：兔較適宜于對急性肺損傷的實驗研究[8]，而在肺癌模型制備方面不是非常成熟，目前主要研究的是原位移植肺癌組織塊和細胞懸液注射法進行移植性建模[9]。

羊：羊的自發(fā)性肺癌與人類極為相似[10]，起源于肺的周圍組織，呈向肺內(nèi)生長的趨勢，有相似的組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)學(xué)特征，可提供癌細胞起源方面的研究信息，較適合于早期肺癌的研究。羊支氣管癌和細支氣管肺泡癌具有相同的臨床、巨檢、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特點，可以提供很多肺泡癌的信息。Palmarini等[10]運用羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入羔羊，成功的誘發(fā)肺腺瘤，是很好的研究細支氣管肺泡癌的研究材料。該模型的優(yōu)點是肺癌的發(fā)生接近自然過程，而缺點是對致癌物的異質(zhì)性反應(yīng)，部分模型腫瘤發(fā)生率較低，培養(yǎng)時間長。

肺癌模型的分類及應(yīng)用

根據(jù)操作方法的不同，誘發(fā)型模型又可以分為以下幾種類型。

1.吸入致癌物法誘發(fā)肺癌

通過氣管切開造瘺術(shù)或直接將動物長期持續(xù)暴露于粉塵或煙霧中，如煙草煙霧[11]、含 NNK[4－（甲基亞硝胺基）－1－（3－吡啶）－1－丁酮]的煙霧等[12]，使用影像學(xué)設(shè)備來觀察腫瘤的發(fā)生，再經(jīng)病理證實，從而證實粉塵和煙霧可引起肺癌。張朝暉等[13]讓小鼠暴露于烹調(diào)油煙8個月，得到小鼠肺組織癌前病變及癌變模型，主要為腺癌；Witschi等[14]用煙草等將A／J小鼠暴露于煙草中5個月，每天暴露6h，然后恢復(fù)4個月，發(fā)癌率均在85%以上，成功建立了吸煙肺癌模型。這種方法常用于病因?qū)W、早期發(fā)生學(xué)的研究，因此適用于早期肺癌的研究。但由于發(fā)生的時間和部位的不確定性，所以這一模型應(yīng)用不多。

2.肺內(nèi)或支氣管灌注致癌物誘發(fā)肺癌

多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）及含苯化合物的致癌作用已經(jīng)眾所周知，并且環(huán)境中的PAH與人類的肺癌發(fā)生有關(guān)。煤焦瀝青（coal tar pitch，CTP）這一致癌物主要含PAH。吳逸明等[15]設(shè)計了用CTP支氣管灌注誘發(fā)大鼠肺癌，構(gòu)建大鼠肺癌發(fā)生、發(fā)展全過程[正常支氣管上皮組織→鱗狀上皮化生→不典型增生→原位癌→浸潤癌（鱗癌）]的動物模型。運用PAH誘發(fā)肺癌動物模型，有助于深入探討人類肺癌的發(fā)病機制。通過對致癌物的灌注量和動物肺鱗癌各病理階段的發(fā)生時間的準確記錄，有助于推算人類接觸類似致癌物可能發(fā)生肺癌的劑量以及出現(xiàn)各種病理階段的時間，為人類肺癌（鱗癌）的預(yù)防和早期診斷提供可靠的實驗依據(jù)。

張玉霞等[16]用含NNK的碘油溶液經(jīng)支氣管內(nèi)灌注，107天后建立了穩(wěn)定的癌前病變，成功率達100%，病理改變從輕度到重度不典型肺泡細胞增生，其中后者比例為67%。該模型定位性好，成瘤數(shù)單一，是較好的研究早期肺癌的動物模型。

3.口服致癌物誘發(fā)肺癌

有科研團隊用黃曲霉毒素類物質(zhì)給NIH小鼠長期灌胃，證實了該類毒物可誘發(fā)小鼠支氣管上皮增生、肺泡上皮增生和肺腺癌[17]。這種模型經(jīng)歷了肺腺癌的癌前病變到肺癌的全過程，處于某個病理階段的時間較長，比較適合早期肺癌各階段的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的研究，但是總的試驗周期比較長（58周）。

4.皮下或腹腔注射誘癌劑誘發(fā)肺癌

有學(xué)者用甲基硝基亞硝基胍皮下注射昆明小鼠誘發(fā)肺腫瘤[18]。此法的特點是操作簡單、誘發(fā)率高（腫瘤發(fā)生率92.3%，腺癌發(fā)生率53.8%）、周期短（僅82天），腫瘤病理類型為肺腺瘤和肺腺癌，包括乳頭狀、腺管狀、實體狀等類型。

烏拉坦是一種較好的致肺部腫瘤藥物[19]，一般經(jīng)腹腔注射。一般來說烏拉坦誘發(fā)的腫瘤均為肺腺瘤，對于A／J系小鼠（敏感系）3個月就可以見到肺腺癌，個體肺癌發(fā)生率100%。

總的來說，誘發(fā)型肺癌模型多經(jīng)過肺癌的各個不同的病理階段，組織學(xué)特點也與人類較為相似，是研究早期肺癌的較好選擇，但不足是尚無小細胞肺癌的報道。

人類肺癌異種異位移植，或動物肺癌同位或異位移植可使一群動物同時接受相當數(shù)量的腫瘤細胞或組織，生長速度較為一致，個體差異較小，成活率高，試驗周期短。用于移植型肺癌研究的實驗動物一般是免疫缺陷動物，包括裸鼠、SCID小鼠及NOD－SCID小鼠等。因移植部位差異分為原位和異位移植兩種類型。

Kondo等[20]分別將人肺腺癌細胞系 A549和 Ma2植入SCID小鼠肺部，制備原位移植肺癌模型，結(jié)果前者出現(xiàn)多樣性轉(zhuǎn)移，后者出現(xiàn)單一轉(zhuǎn)移。Wang等[21]通過肺穿刺和支氣管穿刺將甲基膽蒽（3－methelcholanthrene，MCA）誘發(fā)的同品系癌細胞系注入大鼠支氣管內(nèi)，結(jié)果5天即有肉眼可見的瘤體出現(xiàn)，成功率接近100%。

Lewis肺癌是已被廣泛應(yīng)用于化療藥物測試的一種肺腺癌細胞株，最初來源于C57小鼠，其成瘤性強，在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移性較弱[22]。最近有學(xué)者[23]用不同癌細胞濃度的Lewis肺癌細胞經(jīng)皮肺穿刺進行肺部原位種植，獲得不同程度的成瘤率（最高可達100%），在第3～9天開始成瘤，但第22天就開始出現(xiàn)死亡。

從以上可以看出，移植瘤肺癌模型瘤體生長迅速，成功率高，主要用于抗癌藥物的藥效測試和藥物篩選；由于缺乏肺癌的早期發(fā)生事件，又缺少與正常免疫環(huán)境的相互作用，腫瘤血管形成機制也大有不同，因而不適用于肺癌發(fā)生及早期事件方面的研究。

運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將人肺癌中發(fā)現(xiàn)的癌基因（目的基因）敲入鼠或其它動物受精卵基因組，或者將受精卵基因組內(nèi)抑癌基因的敲除來制造肺癌模型。但這些經(jīng)典的基因工程不能復(fù)制散發(fā)肺癌經(jīng)歷的生長事件，這可能是由于大量轉(zhuǎn)基因癌細胞的微環(huán)境與散發(fā)腫瘤過程中僅少量突變細胞包圍在正常細胞的情況嚴重不符。改良運用癌基因或抑癌基因的等位基因突變技術(shù)可使鼠肺癌的生長過程更接近于散發(fā)腫瘤，即在肺已經(jīng)完全發(fā)育的成年鼠內(nèi)僅一個亞群的細胞獲得突變。

在人類肺腺癌中K－ras基因突變是常見的突變，占1／4～1／2。有學(xué)者用重組腺病毒表達Adeno Cre（一種重組酶）誘導(dǎo)K－ras突變基因在肺的表達，從而達到腫瘤發(fā)生的時間順序性和多樣性，出現(xiàn)了不典型腺瘤樣增生（AAH，2w）、支氣管上皮不典型增生（EH，2w）、支氣管腺瘤（12w）和為數(shù)較少的腺癌（16w）[24]。這種模型能更好地研究不同早期階段的肺癌的發(fā)生發(fā)展，缺點是缺少進展期腫瘤的特征，如間質(zhì)沉積、局部浸潤及轉(zhuǎn)移的潛能，其可能原因是需要聯(lián)合其它基因改變。因此有學(xué)者將條件控制表達的K－ras基因?qū)隩rp53或其它有抑癌基因缺失的小鼠中制造更加進展期的肺癌模型獲得了成功[25]。另外有學(xué)者用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)基因改造小鼠也能獲得相對晚期的腫瘤[26]。Alain等[27]在建立 K－ras肺癌模型的基礎(chǔ)上，成功復(fù)制了人類細支管肺泡癌進展為浸潤性腺癌的病理過程，證實了臨床上的一個假設(shè)：阻遏TGF－βⅡ型受體可能是原位腺癌到浸潤性腺癌的一個很重要的環(huán)節(jié)。

相對于誘發(fā)型肺癌模型，基因改造模型具有時間優(yōu)先性的優(yōu)點。一般第3周即可見到與人類不典型腺瘤樣增生相似的病變。另外它還有另一個優(yōu)勢，就是發(fā)現(xiàn)了少數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌癌的癌變過程，尤其是與人類小細胞肺癌（SCLC）相似的腫瘤。Meuwissen等[28]在Cre－loxP介導(dǎo)的聯(lián)合Rb基因和p53基因失活的情況下建立了與人類SCLC相似的鼠肺癌模型。

肺癌治療失敗的主要原因是由于未能早期診斷，基因改造小鼠肺癌模型提供了足夠時長的各期癌組織，利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的技術(shù)對每個早期癌組織的特異性基因及其特異性蛋白表達譜進行分析，篩選出最好的早期病變的癌組織分子標記物表達譜，從而可能做到早期診斷[29]。

近期的小動物影像技術(shù)如微型CT、微型MRI、超聲及熒光探針成像的發(fā)展，也為腫瘤的早期診斷提供了線索[30]。Namati等[31]用微型CT檢測到非常早期的浸潤前期病變，最小腫瘤僅0.11mm，并用之縱向觀察不同時期病變的變化特點，主要觀察了大小的變化。但其它形態(tài)學(xué)方面的研究還未見報道。最新的微型CT分辨率可達9μm，可用于小動物早期肺癌的形態(tài)學(xué)研究。與分子探針技術(shù)相結(jié)合可用于肺癌早期特異性分子探針的開發(fā)研究。Olson等[32]用7T微型 MRI定量追蹤肺部腫瘤的進展情況，可以觀察0.1～4.0mm的腫瘤。

基因改造型肺癌模型還可以用于與早期基因事件及基因后事件相關(guān)的治療研究。因此，有效基因定位的模型不僅有利于對肺癌病理過程的理解，還能用于靶向治療的臨床前期實驗[33]，包括阻止癌前病變發(fā)展到浸潤性癌變。

綜上所述，誘發(fā)型和基因改造型肺癌模型為我們提供了良好的早期肺癌的研究工具，尤其是條件性表達鼠模型及其與誘發(fā)型聯(lián)合模型的建立，不僅有助于我們研究早期肺癌的發(fā)病機制，也為早期診斷和治療提供了很好的研究平臺。相信隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及小動物影像等新理論、新技術(shù)的發(fā)展，我們能更好地建立更多的與人類肺癌更接近的、適合于特定實驗?zāi)康牡膭游锬Ｐ停瑥亩鵀楦玫匮芯吭缙诜伟﹦?chuàng)造條件。

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