環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在檢測痰標本結(jié)核分枝桿菌中的應用

王靜 張艷 胡鈺卿 竺祖軍 岳永寧 朱敏

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在檢測痰標本結(jié)核分枝桿菌中的應用

王靜 張艷 胡鈺卿 竺祖軍 岳永寧 朱敏

目的 評價結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）快速檢測試劑盒的臨床應用效果。方法選取肺結(jié)核患者183例（肺結(jié)核組）和非肺結(jié)核患者120例（對照組）。采用涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)法和LAMP對痰標本進行檢測，采用結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光檢測試劑盒（TB-PCR）檢測羅氏培養(yǎng)與LAMP結(jié)果不符的標本，分析LAMP與羅氏培養(yǎng)的檢出率及兩者的符合率。結(jié)果去除經(jīng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌的10例標本，涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)法和LAMP的陽性檢出率分為64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173）。LAMP與抗酸染色、羅氏培養(yǎng)陽性檢出率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）,抗酸染色與羅氏培養(yǎng)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303）。結(jié)論結(jié)核分枝桿菌環(huán)介導等溫擴增技術(shù)的靈敏度和特異度高，具有簡單易行、快速準確的特點,在肺結(jié)核患者的早期診斷中將發(fā)揮重要作用。

結(jié)核分枝桿菌 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) 痰

早期準確和廉價的檢測診斷技術(shù)在結(jié)核病的預防、診斷、治療中有著非常重要的作用。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplication,LAMP）是近幾年研究較多的恒溫擴增方法，國內(nèi)外實驗室已進行了相關(guān)研究[1-3]。本實驗室引進最近在國內(nèi)研發(fā)的LAMP恒溫擴增商品試劑盒，筆者通過評估其應用效果，旨在探求一種敏感、準確、快速、低成本、方便操作的方法。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2011-06—10我院結(jié)核病治療中心住院的肺結(jié)核患者183例（其中初治141例，復治42例），男125例，女58例，年齡18～88歲，平均（53±21）歲。所有對象均經(jīng)臨床表現(xiàn)、胸部X線、CT檢查及痰液抗酸染色等確診。選擇同期在我院呼吸科住院的非結(jié)核患者120例，男90例，女30例，年齡18～97歲，平均（69±19）歲。其中肺癌22例,矽肺14例,慢性阻塞性肺氣腫18例及慢性支氣管炎20例,其它各類肺炎46例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準,所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 痰標本采集 囑患者漱口后留早晨第一口痰。

1.2.2 抗酸染色 按照文獻[4]進行。

1.2.3 羅氏培養(yǎng)及菌株菌型鑒定 按照文獻[4]操作。對于羅氏培養(yǎng)陽性菌株使用對硝基苯甲酸（PNB）鑒別培養(yǎng)基（500μg/ml）進行分型，區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復合群與非結(jié)核分枝桿菌。培養(yǎng)基購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司（批號20110625和20110901）。

1.2.4 LAMP檢測 結(jié)核分枝桿菌核酸快速檢測試劑盒由廣州華峰生物科技有限公司提供(批號:20110409)。試劑盒包含4條LAMP引物,引物序列為FIP：ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGTTTTAGAAGTCGGAACCCCT；BIP：ATACGACTTCGAAACCGTCGCCTTTTGGTCAGCCCCTTGTTGAG，F(xiàn)3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT。引入SYBR GreenI核酸染液，直接用肉眼對實驗結(jié)果判定[5]。

1.2.4.1 痰液樣本DNA的制備 （1）初步估計痰樣本量,加入4倍體積4%氫氧化鈉溶液,充分混勻,室溫靜置液化30min；（2）吸取1ml液化痰加入1.5ml無菌離心管中，15 000r/min離心5min，吸棄上清液；（3）沉淀使用1ml 0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15 000r/min離心5 min，棄上清液；（4）采用1ml 0.9%氯化鈉溶液重懸洗滌，15 000r/min離心5min，棄上清液，沉淀用于模板提??；（5）分別加入100μl DNA提取液Ⅰ和0.25μl Proteinase K，56℃溫浴30 min，再沸水浴10 min；（6）加入12.5μl DNA提取液Ⅱ，稍混勻，12 000r/min離心5min，上清液即為DNA模板。

1.2.4.2 LAMP擴增反應 （1）在解凍后的HF管內(nèi)按順序分別加入陰性對照模板、待測標本模板和陽性對照模板各2.5μl；（2）放置65℃水浴箱恒溫反應60min；（3）反應結(jié)束后使反應管冷卻，顛倒混勻HF管。

1.2.4.3 結(jié)果判讀 （1）若待檢樣品反應管液體變?yōu)榫G色，說明該管發(fā)生了特異性擴增，為結(jié)核分枝桿菌陽性；（2）若待檢樣品反應管液體仍為橙色，說明未發(fā)生特異性擴增，為結(jié)核分枝桿菌陰性。

1.3 結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光體外檢測（TB-PCR）當同樣的標本羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結(jié)果不一致時，采用TB-PCR對備份樣品進行檢測。試劑盒購自深圳匹基生物工程有限公司（批號：20110307）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。以羅氏培養(yǎng)基檢測結(jié)果為金標準，計算LAMP檢測的敏感度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。陽性檢出率組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 肺結(jié)核組3種檢測方法陽性率的比較 肺結(jié)核組羅氏培養(yǎng)陽性122例，所有陽性菌株均經(jīng)PNB培養(yǎng)基進行結(jié)核分枝桿菌復合群與非結(jié)核分枝桿菌鑒定，其中LAMP陰性培養(yǎng)陽性的10例痰標本為非結(jié)核分枝桿菌（未進行進一步分型）。剩余的173例標本中，抗酸染色、羅氏培養(yǎng)、LAMP的陽性檢出率分別為64.1%（111/173）、64.7%（112/173）、78.6%（136/173），LAMP試驗與抗酸染色陽性檢出率的差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 8.84，P＜0.01），與羅氏培養(yǎng)法的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.20，P＜0.01），抗酸染色法與羅氏培養(yǎng)的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.02，P＞0.05）。

2.2 兩組患者LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果比較肺結(jié)核組122例羅氏培養(yǎng)陽性中LAMP檢測陽性108例，陰性14例；61例羅氏培養(yǎng)陰性中LAMP檢測陽性28例，陰性33例。對照組120例痰標本中，羅氏培養(yǎng)均為陰性，LAMP檢測陽性4例。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為 88.5%（108/122）、82.3%（149/181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303）。

2.3 TB-PCR檢測結(jié)果 兩組患者的痰標本中羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結(jié)果不符的標本共46例，其中34例LAMP檢測結(jié)果與TB-PCR檢測結(jié)果一致，詳見表1。

表1 羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結(jié)果不一致的標本

3 討論

為了尋找快速靈敏的結(jié)核病感染檢測診斷方法,目前已有多種核酸擴增方法，如羅氏公司Amplicor檢測系統(tǒng)[6]、Genprobe的rRNA擴增結(jié)核分枝桿菌直接反應（AMTD）[7]、連接酶鏈式反應[8]、Q-β復制酶擴增法[9]、鏈置換擴增法[10]，但以上基因?qū)W檢測方法都需要昂貴的儀器設備以及實驗室條件，限制了這些方法的廣泛應用。

LAMP檢測是近年發(fā)展起來的核酸體外擴增技術(shù)，該方法最初是由Notomi等[11]設計用于病原微生物的檢測，其針對靶基因的6個區(qū)段，在一個恒定65℃下即可完成擴增，可一步完成基因的擴增和產(chǎn)物的檢測，并在15～60min內(nèi)擴增109～1 010倍，擴增效率極高,擺脫了特殊儀器的限制，操作更加的簡單、方便，適合大量樣品高通量檢測，通過判別擴增產(chǎn)物的有無來對靶基因序列進行檢測，結(jié)果判斷簡單，可通過比濁法[4]和紫外線法兩種方法進行。

本研究顯示，LAMP檢測的陽性率（78.6%）明顯高于抗酸染色法（64.1%）、羅氏培養(yǎng)（64.7%）。以羅氏培養(yǎng)為金標準，LAMP檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值分別為88.5%（108/122）、82.3%（149/ 181）、77.1%（108/140）、91.4%（149/163），LAMP檢測與羅氏培養(yǎng)的符合率為84.8%（257/303），與國外文獻報道基本相似[1-3]。由于羅氏培養(yǎng)陽性菌株中包括MTB和NTB，因此其特異度較低；另外，由于羅氏培養(yǎng)的營養(yǎng)條件等因素的限制,檢測臨床標本的MTB敏感度偏低。上述缺點導致本方法與羅氏培養(yǎng)檢測結(jié)果符合率偏低問題。本研究選用TB-PCR試劑盒，對羅氏培養(yǎng)和LAMP檢測結(jié)果不符的標本進行第3方檢測評價，TBPCR試劑盒作為MTB檢測試劑，具有較高的靈敏度和特異度。在46例羅氏培養(yǎng)與LAMP檢測結(jié)果不符的標本中，34例LAMP與TB-PCR檢測結(jié)果相符。

本研究發(fā)現(xiàn)了LAMP檢測過程從樣品制備到結(jié)果報告,所需時間短，僅需3h，通過肉眼可迅速觀察到實驗結(jié)果，并且可以較準確地對標本中是否含有結(jié)核分枝桿菌復合群做出快速鑒定，為臨床醫(yī)師對肺結(jié)核患者早期診斷和鑒別診斷提供了重要依據(jù)。因此，LAMP恒溫擴增技術(shù)具用高靈敏度、高特異度、操作簡單、設備要求低、實驗人員快學易接受等優(yōu)點，在經(jīng)濟條件欠發(fā)達的發(fā)展中國家具有巨大的發(fā)展前景。

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Evaluation of loop-mediated isothermal amplification in direct detection mycobacterium tuberculosis DNA of sputum samples

ObjectiveTo assess the clinical use of the loop-mediated isothermal amplification(LAMP)assay for detection mycobacterium tuberculosis in sputum samples.MethodsLAMP with acid-fast bacilli(AFB)smear microscopy and Lowenstein-Jensen(L-J)culture,were performed in 183 sputum specimens from pulmonary tuberculosis patients and 120 sputum specimens from non-pulmonary tuberculosis patients.The samples with different results between LAMP and L-J culture were tested by mycobacterium tuberculosis PCR fluorescence diagnostic kits.L-J culture positive strains were identified by p-Nitrobenzoic acid medium.The sensitivity and specificity of LAMP were calculated according to the result of L-J culture.The detection rates of the 3 methods were analyzed according to the clinical diagnosis and the differences were analyzed by chi-square test.ResultsFor tuberculosis patient(removing 10 samples caused by NTM),the detection rate of AFB,L-J culture and LAMP were 64.1%(111/173)、64.7%(112/173)、78.6%(136/173),respectively.The differences between LAMP and other 2 methods were signifinant(P＜0.01).The difference between the detection rates of AFB and L-J culture was not significant(P＞0.05).With the results of L-J culture as the reference,the sensitivity、specificity、positive and negative predictive values of LAMP were 88.5%(108/122)、82.3%(149/181)、77.1%(108/140)、91.4%(149/163),respectively.The accordance rate of LAMP and L-J culture was 84.8%(257/303). Conclusion LAMP is a rapid,sensitive and specific method for detection of mycobacterium tuberculosis in clinical sputum samples.

Mycobacterium tuberculosis Loop-mediated isothermal amplification Sputum

2012-11-22）

（本文編輯：嚴瑋雯）

310003 杭州市紅十字會醫(yī)院結(jié)核病治療中心

王靜，E-mail：wj_wzmc@163.com

[1] Ehsan Aryan,Manoochehr Makvandi,Ahmad Farajzadeh,et al.