間歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表達

徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

間歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表達

徐曉梅 樊榮 黃曉穎 林乾頂 王良興

目的 探討間歇缺氧對大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1含量的影響。 方法 清潔SD大鼠30只，隨機分成3組（每組10只）：正常對照組、間歇缺氧組、持續(xù)缺氧組，普通飼料飼養(yǎng)。正常對照組：常壓、常氧下飼養(yǎng)；間歇低氧組：每90s一循環(huán)，氧艙內低氧濃度維持在6%～8%，持續(xù)10s以上；持續(xù)低氧組：氧艙內氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動物入艙，至下午5：00試驗結束，每天持續(xù)8h，連續(xù)35d。然后經右頸動脈抽血，處死大鼠分離其心臟，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）測定血清中NF-kBp65以及MCP-1含量，采用免疫印跡法測定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。 結果 與正常對照組相比，在間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組中大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量明顯增加。 結論 間歇缺氧可導致NF-kB的激活，從而導致大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的表達增加。

缺氧 心肌 NF-kBp65 MCP-1 大鼠

Hypoxia Heart muscle NF-kBp65 MCP-1 Rats

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAHS）以夜間反復發(fā)生的上氣道阻塞或狹窄而導致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS是心血管疾病的獨立危險因素。OSAHS似乎與系統(tǒng)性炎癥有關[1]，這可能是導致心血管疾病的機制之一，而系統(tǒng)性炎癥的中心環(huán)節(jié)則是核因子-kB（NF-kB）。NF-kB是調節(jié)免疫反應、應激反應、凋亡和炎癥反應的中心環(huán)節(jié)。所以NF-kB激活可能是心血管疾病的始動機制。而缺氧可導致NF-kB激活。因此我們推測OSAHS可能通過間歇缺氧導致NF-kB激活，引起系統(tǒng)性炎癥反應，進而導致心血管疾病的發(fā)病率增加。

本研究模擬OSAHS患者的間歇缺氧狀態(tài)，測定間歇缺氧大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量，以明確缺氧狀態(tài)下炎癥蛋白的表達是否增加，進而導致心血管疾病發(fā)病率增加。

1 對象和方法

1.1 對象 由溫州醫(yī)學院動物試驗中心提供，共清潔SD雄性大鼠30只，按照體重相匹配隨機分為3組，每組10只。喂養(yǎng)均采用相同飼料，由溫州醫(yī)學院動物試驗中心統(tǒng)一提供。正常對照組：常壓、常氧下飼養(yǎng)；間歇低氧組：每90s一循環(huán)，氧艙內低氧濃度維持在6%～8%，持續(xù)10s以上；持續(xù)低氧組：氧艙內氧濃度維持在8%～11%。每天早上9：00動物入艙，至下午5：00試驗結束，每天持續(xù)8h，連續(xù)35d。

1.2 方法 研究結束后經頸內靜脈抽血法處死大鼠快速沿右室壁分離大鼠的左、右心室，稱取重量后置入塑料管中置入液氮罐中固定，然后轉移至-80°C冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血清NF-kBp65、MCP-1含量。采用免疫印跡法測定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。首先收集心肌細胞，預冷的PBS洗滌2次，加入蛋白質抽提試劑輕輕搖動5min，加入裂解液，冰浴下?lián)u動15min進行裂解，14 000g離心15min，采用BCA法進行蛋白定量。蛋白經SDS-PAGE電泳轉移至PVDF膜上，膜在5%BSA溶液中室溫孵育1h以封閉膜上的非特異結合。TBS/T洗膜3次，每次5min，封閉過的膜加入一級抗體4℃過夜，抗原抗體結合。TBS/T洗膜3次，每次5min，加入HRP標記的二級抗體以結合一級抗體，室溫孵育膜1h。TBS/T洗膜3次，每次5min。將膜置于反應液中室溫孵育5min。去除過量的溶液，將膜夾在兩塑料薄膜之間，以X線膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用表示，采用非參數(shù)檢驗符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，其中兩組間比較采用LSD法。

2 結果

2.1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較 見表1。

表1 3組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比較（ng/L）

由表1可見，與正常對照組比較，間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平明顯升高，并且差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組相比較，雖然間歇缺氧組比持續(xù)缺氧組血清NF-kB以及MCP-1水平表達有所增加，但無統(tǒng)計學意義。

2.2 3組大鼠心肌中NF-kB以及MCP-1的表達電泳圖 見圖1、2。

圖1 3組大鼠心肌NF-kBp65的表達電泳圖（N:正常對照組；CH：持續(xù)缺氧組；IH：間歇缺氧組）

圖2 3組大鼠心肌MCP-1的表達電泳圖（注釋同圖1）

由圖1、2可見，在間歇缺氧組以及持續(xù)缺氧組中，大鼠心肌NF-kBp65以及MCP-1表達增加，尤以在間歇缺氧組中明顯。

3 討論

OSAHS以夜間反復發(fā)生的上氣道阻塞或狹窄而導致的間歇低氧血癥為臨床特征。研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS是心血管疾病的獨立危險因素。OSAHS似乎與系統(tǒng)性炎癥有關，這可能是導致心血管疾病的機制之一，而系統(tǒng)性炎癥的中心環(huán)節(jié)則是NF-kB。NF-kB是調節(jié)免疫反應、應激反應、凋亡和炎癥反應的中心環(huán)節(jié)[2]。

NF-kB是參與免疫與炎癥反應的重要轉錄因子，能被多種細胞外信號，包括缺氧所激活[3]。NF-kB迅速核移位，進入核內調節(jié)多種基因，包括多種細胞因子（TNF-a等）、急性時相蛋白（CRP）、黏附分子如細胞間黏附分子-1和血管內皮黏附分子-1等、趨化因子如單核細胞趨化蛋白-1等的表達，參與炎癥反應。

MCP-1屬于趨化因子家族中的C-C亞家族成員，單核細胞的趨化主要是由MCP-1來實現(xiàn)的，它能使血液中的單核細胞遷入內膜下，活化為巨噬細胞，吞噬脂質形成泡沫細胞，在動脈粥樣硬化（artheroscleros,AS）的早期起著重要作用。同時，在AS發(fā)生后期，MCP-1對于促進斑塊的不穩(wěn)定也發(fā)揮著作用。MCP-1可由體內多種細胞分泌，包括平滑肌細胞、內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞等，它能趨化多種炎性細胞向病變部位聚集，并對多種炎癥因子的刺激作出應答，從而直接或間接地參與了AS得形成。Martinovic等[4]對263例志愿者研究發(fā)現(xiàn)，血清MCP-1水平升高增加了冠狀AS的發(fā)病風險。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，間歇缺氧確實可以使血清以及心肌中NF-kB以及MCP-1表達明顯增加，這可能是由于缺氧激活NF-kB成活化狀態(tài)，進而再激活其它炎癥因子如MCP-1等，導致系統(tǒng)性炎癥反應，從而導致缺氧狀態(tài)下心血管疾病發(fā)病率升高。這可能是OSAHS患者易發(fā)生心血管疾病的可能機制之一。

[1]Selmi C,Montano N,Furlan R,et al.Inflammation and oxidative stress in obstructive sleep apnea syndrome[J].Exp Biol Med, 2007,232(11):1409-1413.

[2]Williams A,Scharf S M.Obstructive sleep apnea,cardiovascular disease,and inflammation-is NF-kB the key[J]?Sleep Breath, 2007,11(2):69-76.

[3]Greenberq H,Ye X,Wilson D,et al.Chronic intermittent hypoxia activates nuclear factor-kappa B in cardiovascular tissues in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(2):591-596.

[4]Martinovic I,Abegunewardene N,Seul M,et al.Elevated monocyte chemoattractaut protein-1 serum levels in patients at risk for cOr-onary artery disease[J].Circ J,2005,69(12):1484.

2011-12-12）

（本文編輯：沈昱平）

溫州市科技局資助項目（Y20090125）

325000 溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院呼吸內科

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart muscle in intermittent hypoxia rats. Methods There are thirty SD rats were randomly assigned into three groups:control group,intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group,which were exposed to air,intermittent hypoxia and continuing hypoxia respectively 8h/d for 35d.Then the blood and heart samples were collected,and the NF-kBp65 and MCP-1 levels in serum and in heart tissue were measured with ELISA and Western blot respectively. Results Compared to the control group the contents of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart were increased both in intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group. Conclusion NF-kBp65 and MCP-1 in heart and blood of intermittent hypoxia rats,which may be associated with the activation of NF-kB by hypoxia.