受體型酪氨酸激酶變異體對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力影響的研究

杜衛(wèi)東 何超 王達(dá) 馬建軍

受體型酪氨酸激酶變異體對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力影響的研究

杜衛(wèi)東 何超 王達(dá) 馬建軍

目的 研究受體型酪氨酸激酶變異體RON△160表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、浸潤能力的影響。 方法 將攜有受體型酪氨酸激酶RON變異體RON△160 cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO細(xì)胞，挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆，以過河實(shí)驗(yàn)和Transwell趨化運(yùn)動實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；Matrigel基質(zhì)浸潤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞浸潤能力，Western blot檢測E-鈣粘連蛋白（E-cadherin）表達(dá)的變化。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染RON△160后RKO細(xì)胞的過河時間為（38．00±1．63）h，明顯短于未轉(zhuǎn)染組與載體對照組的（69．50±2．52）h與（72．00±1．63）h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。轉(zhuǎn)染后RKO細(xì)胞的穿膜能力顯著增強(qiáng)，穿膜細(xì)胞數(shù)為（59．22±6．67）個/HP、未轉(zhuǎn)染組為（25．90±4．56）個/HP、載體對照組為（28．33±6．75）個/HP，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。轉(zhuǎn)染RON△160后，RKO細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低（P＜0．05）。 結(jié)論 RON△160轉(zhuǎn)染可以降低E-cadherin表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞間的黏附性，增加結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的移動、浸潤能力。RON△160的表達(dá)可能是結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。

受體型酪氨酸激酶變異體 E-鈣粘連蛋白 結(jié)腸腫瘤 腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移

研究發(fā)現(xiàn)，受體型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和生存中起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。RON（recepteur d'origine nantais）是RTKs中的一種，體外研究發(fā)現(xiàn)RON的激活可引起上皮細(xì)胞的分化、遷移和基質(zhì)侵襲。Zhou等[1]報道了RON的3種異構(gòu)體，分別是RON△165、RON△160和RON△155，本研究著重研究RON△160在結(jié)腸癌遷移浸潤中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；Hygromycin B購于Roche公司；兔抗RON β鏈C末端多肽IgG由王明海教授惠贈；鼠抗人E-鈣粘連蛋白（E-cadherin）一抗、巨噬細(xì)胞刺激蛋白（macrophage stimulating protein,MSP）和細(xì)胞浸潤小室均為BD公司產(chǎn)品；HRP羊抗兔IgG及HRP羊抗鼠IgG購于Jackson公司；48孔標(biāo)準(zhǔn)趨化小室和聚碳酸脂微孔濾膜購于Neuro Probe公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞株與質(zhì)粒 結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、RKO、DLD1、SW620、SW480為本實(shí)驗(yàn)室所購存。真核表達(dá)載體pcDNA3.1-RON△160為王明海教授惠贈。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與克隆化培養(yǎng) （1）取對數(shù)生長期的RKO細(xì)胞 (70%～80%融合)5×104個/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24h后，以不同終濃度加入Hygromycin B，觀察14d，得出其最小生長抑制濃度200mg/L。（2）取對數(shù)生長期的RKO細(xì)胞接種于直徑6cm板中培養(yǎng)至80%融合。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RON△160 2μg與 lipofectamineTM15μl混勻后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，12～18h后更換為普通培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以100∶1稀釋傳代至9cm直徑的培養(yǎng)皿以200 mg/L Hygromycin B選擇培養(yǎng)7～10d，待單個克隆肉眼可見時，以0.25%的胰酶消化挑選克隆。同時以轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞RKO-pcDNA3.1為載體對照。

1.3 體外跨室趨化運(yùn)動能力的檢測 趨化小室下室每室加入29μl含MSP的RPMI 1640無血清培養(yǎng)基，MSP的濃度梯度分別為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0×103nmol/ L。覆蓋Ⅳ型膠原包被的聚碳酸酯微孔濾膜和乳膠隔墊，安裝好上室。調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個/ml，上室加入細(xì)胞懸液45μl/室，每組2個復(fù)孔。37℃、5%CO2孵育5h，取出聚碳酸酯微孔濾膜，濾膜上面細(xì)胞用特殊刮膜器刮除干凈，下層黏附的穿膜細(xì)胞以瑞氏染液固定染色15min。于鏡下隨機(jī)取上、下、左、右、中心5個高倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取每個視野的平均數(shù)代表細(xì)胞的侵襲能力；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 過河實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)） 生長旺盛的RKO細(xì)胞以0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清培養(yǎng)基制備成1.5×105個/ml的細(xì)胞懸液，以1ml/孔接種于24孔板，培養(yǎng)至基本鋪滿。PBS洗滌1遍，100μl移液器頭在孔中劃一直線，PBS再洗滌2次，加入含MSP的培養(yǎng)液(1ml/孔)至終濃度2×103nmol/L繼續(xù)培養(yǎng)，對照加入等量無藥培養(yǎng)液。24h后每2h觀察1次，至劃痕被細(xì)胞填滿。觀察劃痕填滿時間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 體外Matrigel基質(zhì)浸潤實(shí)驗(yàn) Transwell小室杯底由8μm孔徑的聚碳酸脂微孔濾膜封閉，濾膜上均勻涂布人工基質(zhì)Matrigel，主要含有Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白。上室以無血清培養(yǎng)基室溫水化2h后，緩慢加入細(xì)胞2×105/室（0.3ml），下室加入含10%小牛血清的培養(yǎng)基0.5ml和2.0×103nmol/ml MSP，每組2個復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，棄上室液，拭去上層膜面細(xì)胞，穿過基底膜的細(xì)胞黏附于膜下層，以瑞氏染液染色10min，洗滌后100倍光鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，每膜計(jì)算5個視野，取均值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測細(xì)胞中RON和E-cadherin的表達(dá) 收集細(xì)胞后提取蛋白，上樣檢測，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后以Hp Scanjet 4 700c掃描儀掃描，Kodak Digital Science 1D軟件分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RON△160轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 RON△160轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)后，RKO細(xì)胞形態(tài)由原來呈短棒狀、紡錘形、多邊形變?yōu)樗笮位蛐螒B(tài)異常的狹長形，見圖1。

圖1 RON△160轉(zhuǎn)染后RKO細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（A：未轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞；B：轉(zhuǎn)染RON△160的RKO細(xì)胞；C：載體對照的RKO細(xì)胞，×100）

2.2 Western blot檢測細(xì)胞中RON的表達(dá) Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RKO細(xì)胞不表達(dá)RON，轉(zhuǎn)染RON△160后，經(jīng)Western blot鑒定篩選出RON△160陽性表達(dá)克隆，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞與載體對照細(xì)胞均無表達(dá)，見圖2。

圖2 Western blot檢測細(xì)胞中RON△160的表達(dá)（A：未轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞；B：載體對照的RKO細(xì)胞；C：轉(zhuǎn)染RON△160的RKO細(xì)胞；D：陽性對照NIH3T3-RON細(xì)胞）

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá) Western blot提示轉(zhuǎn)染成功后，RON△160-RKO細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯低于載體對照細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞（P＜0.05），見圖3。

2.4 體外跨室趨化運(yùn)動能力實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染RON△160后RKO細(xì)胞的穿膜移動能力顯著增強(qiáng)（P＜0.01），且隨著配體MSP濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)2nmol/L以上時，增勢趨緩。而未轉(zhuǎn)染組與載體對照組即使有MSP的刺激，其移動能力也無明顯增強(qiáng)，見圖4。

圖3 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá)

圖4 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞趨化運(yùn)動能力比較

2.5 過河實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染RON△160后并經(jīng)MSP刺激后，RKO細(xì)胞遷移能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；無MSP刺激情況下，其過河時間也比載體對照組和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞短（P＜0.05），見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞遷移能力比較（h）

2.6 體外Matrigel基質(zhì)浸潤實(shí)驗(yàn) RON△160轉(zhuǎn)染細(xì)胞穿膜數(shù)為（59.22±6.67）個/HP、未轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞為（25.9±4.56）個/HP、載體對照組為（28.33±6.75）個/HP，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞體外基質(zhì)浸潤能力比較

3 討論

RON又稱為MSP受體（MST1R），其cDNA最早從角質(zhì)細(xì)胞中被克隆[2]。編碼基因位于染色體3p21，是一個腫瘤中常見的突變區(qū)域[3-4]。RON基因包含20個外顯子，其主要產(chǎn)物是一種糖基化單鏈前體，水解斷裂后形成由40kd的α鏈和150kd的β鏈組成的、由二硫鍵連接的雜二聚體，β鏈包括三個部分，一段暴露于細(xì)胞膜外，一小段跨膜，另一段具有酪氨酸激酶活性的部分在胞漿內(nèi)[2]。其配體是MSP，MSP由肝臟產(chǎn)生，又稱為類肝細(xì)胞生長因子，其分子量為78kd，為二硫鍵相連的雙鏈結(jié)構(gòu)，MSP與RON結(jié)合后第1 238和1 239位的酪氨酸磷酸化，可增加激酶活性。

RON屬于RTK亞家族中成員之一,主要表達(dá)在上皮來源的細(xì)胞，活化后引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化、生長、遷移和基質(zhì)侵襲。Zhou等[1]研究發(fā)現(xiàn)RON有3種變異體RON△165、RON△160和RON△155。Lu等[5]又報道了RON△110和RON△55、RONE5/6in等變異體并重點(diǎn)研究了RON△160。RON△160是由RON缺失了外顯子5、6編碼的β鏈上第一個免疫球蛋白叢狀蛋白域的109個氨基酸拼接而成。本研究提示轉(zhuǎn)染RON△160后，RKO細(xì)胞過河時間較未轉(zhuǎn)染組與載體對照組明顯縮短。體外趨化運(yùn)動能力實(shí)驗(yàn)也證實(shí)轉(zhuǎn)染RON△160后RKO細(xì)胞的穿膜移動能力顯著增強(qiáng)，且隨著配體MSP濃度的增加而增加。Lu等[5]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RON160的MDCK細(xì)胞，在無MSP刺激時16h的過河率達(dá)86%，有MSP刺激時16h的過河率達(dá)93%。與其他研究一致，本研究結(jié)果表明RON△160的表達(dá)可使RKO細(xì)胞縱向的穿膜能力與橫向的移動能力均增加。同時，表達(dá)RON△160的RKO細(xì)胞基質(zhì)浸潤能力也增加。在Lu等[5]的研究中，轉(zhuǎn)染并表達(dá)RON△160的NIH3T3細(xì)胞在軟瓊脂中克隆的形成數(shù)量及大小均顯著高于對照，顯示了RON△160與成瘤作用的關(guān)系。

E-cadherin是一種跨膜糖蛋白，廣泛分布于上皮組織中，介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附并維持上皮細(xì)胞的正常形態(tài)。E-鈣基因是一個重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[6]。在杜衛(wèi)東等[7]既往的研究中發(fā)現(xiàn)RKO細(xì)胞轉(zhuǎn)染并高表達(dá)野生型RON后，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，E-cadherin表達(dá)降低，而本研究中表達(dá)RON△160的RKO細(xì)胞同樣出現(xiàn)了類似變化，這種變化稱為上皮細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMTs）。其標(biāo)志是上皮特性的丟失和間質(zhì)表型的獲得，細(xì)胞表型梭型化，細(xì)胞連接處E-cadherin減少，細(xì)胞骨架重構(gòu)，并表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞特有的細(xì)胞標(biāo)志如α-SMA、Vimentin等。EMTs多發(fā)生在傷口愈合、腫瘤進(jìn)展過程中，大多數(shù)浸潤性或轉(zhuǎn)移性腫瘤存在部分或全部EMTs，表明EMTs是體內(nèi)一些上皮細(xì)胞性癌浸潤轉(zhuǎn)移的的重要步驟[8]，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附松散，易從原發(fā)部位脫落，啟動腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的第一步。一般說腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移遵循規(guī)律：瘤細(xì)胞亞克隆出現(xiàn)→黏附力減弱使得瘤細(xì)胞解離→突破基底膜并溶解細(xì)胞外基質(zhì)→移動或漂流到他處與基底膜黏附、定植→腫瘤血管形成及增殖轉(zhuǎn)移灶形成。腫瘤細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮?，可使?xì)胞的移動能力和基質(zhì)浸潤能力增強(qiáng)，更容易破壞鄰近正常組織，進(jìn)入血管淋巴管，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這種促進(jìn)遷移、浸潤的變異體剪切現(xiàn)象在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、腦腫瘤中多有發(fā)現(xiàn)[9-10]，但在正常組織中未發(fā)現(xiàn)。這提示RON表達(dá)異常增高及RON變異體的蓄積可能在結(jié)直腸癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用。

Zhang等[11]的研究還提示RON△160還可通過降低緊密連接蛋白claudin-1、重分布claudin-3、claudin-4從而破壞細(xì)胞間的緊密連接，這樣導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生EMTs同時又改變細(xì)胞間通訊，增強(qiáng)成瘤性和遷移能力。

綜上所述，RON△160轉(zhuǎn)染可以降低腫瘤細(xì)胞間的黏附性，增加細(xì)胞的移動、浸潤能力，提示RON變異體RON△160表達(dá)可能是結(jié)腸癌浸潤、轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一，具體有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Receptor tyrosine kinase RON△160 on motile/invasive ability of human colorectal cell line RKO

Objective To investigate effects of receptor tyrosine kinase RON△160 on motile/invasive ability of human colorectal cancer cell line RKO．Methods The eukaryotic expression vector pcDNA3．1-RON△160 was transfected into colorectal cancer RKO cells and a stable expression clone was obtained．The motile ability of RKO cells was assessed by wound healing test and the Transwell migration assay;the invasive ability was tested by Matrigel invasion method and the expression of E-cadherin was detected by Western blot． Results Transwell chemotaxis assay revealed that the motile ability of transfected RKO cells was greatly enhanced(P＜0．01)．The wound healing time of transfected RKO cells(38．00±1．63h)was significantly shorter than those in parental cells(72．00±1．63h)and control cells(69．50±2．52h)(P＜0．05)．The penetrated cells for above three groups were 59．22±6．67/HP,25．90±4．56/HP and 28．33±6．75/HP,respectively in the Matrigel invasion test(P＜0．01)．E-cadherin expression decreased statistically in pcDNA3．1-RON△160 transfected cells(P＜0．05)．Conclusion Transfection of RON△160 to colorectal cancer RKO cells can decrease of E-cadherin expression and cell-cell adhension,while migration/invasion ability is enhanced,indicating RON△160 might play roles in migration/invasion of colorectal cancer．

Receptor tyrosine kinase variantE-cadherin Colorectal carcinoma Migration/invasion

2012-12-03）

（本文編輯：胥昀）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30471986）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院普外科八病區(qū)（杜衛(wèi)東）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院臨床研究所（何超、王達(dá)、馬建軍）

何超，E-mail：hzdwd2004@sina.com