反相高效液相色譜法測(cè)定替硝唑氯化鈉注射液中乙二胺四乙酸二鈉含量

陸 瀅

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224000)

替硝唑氯化鈉注射液對(duì)大多數(shù)厭氧菌有較強(qiáng)抗菌作用，臨床用于各種厭氧菌感染，如敗血癥、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支氣管感染。但在臨床使用時(shí)，替硝唑氯化鈉注射液有時(shí)會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。有研究表明，替硝唑氯化鈉注射液處方中添加乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)后可顯著提高輸液的穩(wěn)定性，其原理為EDTA與輸液中微量的金屬離子形成螯合物后，阻止了金屬離子對(duì)藥物自身氧化的催化作用。因此在替硝唑氯化鈉注射液處方中添加一定量的EDTA作為螯合劑，可顯著改善輸液的配伍穩(wěn)定性。但如人體大量攝入EDTA，它會(huì)與血液及骨骼中經(jīng)過的鈣形成水溶性螯合物，被排除體外，引起低血鈣或骨鈣流失，因此有必要對(duì)EDTA的含量進(jìn)行控制，雖然已有EDTA的檢測(cè)報(bào)道，但所用方法不能定量檢測(cè)。為確保用藥安全，筆者參照相關(guān)文獻(xiàn)建立了替硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，Agilent-1200型色譜工作站(美國(guó)Agilent公司);BP211D型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);Seven Easy pH計(jì)(上海精密儀器科學(xué)儀器有限公司)。替硝唑氯化鈉注射液(山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為 1121007，1120527，1120102，規(guī)格為 100 mL∶替硝唑 0．4 g與氯化鈉 0．9 g);乙腈(美國(guó)Tedia公司)為色譜純，乙二胺四乙鈉二鈉磷酸、10%四丁基氫氧化銨溶液，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-緩沖液(10%四丁基氫氧化銨溶液6 mL，加水稀釋至200 mL，以磷酸調(diào)節(jié)pH至6．5)-水(20∶20∶60);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:1．0 mL/min，柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2．2 溶液制備

精密稱取EDTA適量，加水使溶解并定量稀釋成0．5 g/L的EDTA溶液，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得對(duì)照品溶液。精密量取替硝唑氯化鈉注射液適量(相當(dāng)于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。精密稱取不含EDTA的空白制劑適量(相當(dāng)于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量使溶解，加1%硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，即得空白對(duì)照溶液。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):精密稱取EDTA空白對(duì)照溶液、供試品溶液及對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，EDTA峰的理論板數(shù)約為2 000，奧美拉唑鈉與EDTA的分離度良好，見圖1。

線性關(guān)系考察:精密吸取 0．5 g/L 的 EDTA 溶液 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，16．0 mL 分別置 50 mL 容量瓶中，加 1%硫酸銅溶液10 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過，分別精密量取續(xù)濾液20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖以EDTA進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=53 653．764 5 X-1 486．165 8，r=0．999 8。結(jié)果表明，EDTA進(jìn)樣量在0．1～2．0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為1121007)的供試品溶液，精密吸取20 μL，每間隔一定時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)定，以峰面積考察。結(jié)果的 RSD為0．93%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn):取同一批(批號(hào)為1121007)替硝唑氯化鈉注射液6份，依法平行測(cè)定其含量，結(jié)果EDTA的平均含量為每瓶4．43 mg，RSD為1．45%，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn):稱取3批(批號(hào)分別為1121007，1120527，1120102)已知含量的樣品，每批3份，精密稱定，分別加入對(duì)照品適量，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

檢測(cè)下限考察:取EDTA溶液(0．51 g/L)1 mL，置10 mL容量瓶中制成混合液[1]，取混合液依次稀釋至1 000倍時(shí)，信噪比[2](S/N)約為 10。檢測(cè)限質(zhì)量濃度約為 0．51 μg/mL。

表1 EDTA加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2．4 樣品含量測(cè)定

精密量取本品適量(相當(dāng)于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水適量，加1%的硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以 0．45 μm 的微孔濾膜濾過，精密量取 20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，另精密稱取EDTA 25 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%的硫酸銅溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，以0．45 μm的微孔濾膜濾過，同法測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，結(jié)果批號(hào)分別為1121007，1120527，1120102的樣品EDTA含量分別為 4．43，4．41，4．61，4．71，4．57，4．51 mg/瓶。

3 討論

由于EDTA易與金屬離子絡(luò)合，在色譜柱中，EDTA和色譜柱不銹鋼表面會(huì)發(fā)生絡(luò)合，導(dǎo)致EDTA的相應(yīng)值變低峰形嚴(yán)重拖尾。本法采用硫酸銅溶液，使EDTA和銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，可以避免EDTA和色譜柱不銹鋼表面發(fā)生作用，提高檢測(cè)靈敏度，改善峰形。研究表明，1%的硫酸銅溶液的用量為10 mL時(shí)，EDTA的峰形較好，故以此作為反應(yīng)濃度。

在加硫酸銅溶液進(jìn)行反應(yīng)時(shí)溶液會(huì)發(fā)生渾濁，因此在反應(yīng)完成后，用0．45 μm的微孔濾膜過濾，防止堵塞和污染色譜柱，同時(shí)也降低了對(duì)EDTA測(cè)定的干擾作用。采用本法測(cè)定替硝唑氯化鈉注射液中EDTA的含量，具有簡(jiǎn)捷方便，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，色譜峰峰形好，分離度好的特點(diǎn)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]．中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:140，622，附錄ⅩD．

[2]張俊松，戚 燕，王曉利，等．注射用奧美拉唑中微量EDTA的檢查[J]．藥物分析雜志，2006，26(12):1 721-1 722．