高效液相色譜法測定大鼠血漿中咪達(dá)唑侖含量＊

劉宏達(dá)，張志清，任靜華，何文娟

(1．河北省滄州市人民醫(yī)院，河北 滄州 061000;2．河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

咪達(dá)唑侖又稱速眠安，屬苯二氮 類鎮(zhèn)靜催眠藥。咪達(dá)唑侖為親脂性物質(zhì)，能直接抑制腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)，具有強(qiáng)大的鎮(zhèn)靜催眠作用，臨床廣泛用于抑郁癥、焦慮等疾病。其在pH＜4的酸性溶液中形成穩(wěn)定的水溶性鹽，臨床制劑為鹽酸鹽或馬來酸鹽。咪達(dá)唑侖主要在肝臟經(jīng)肝微粒體酶CYP3A4氧化，因此經(jīng)常將此藥作為探針?biāo)幬颷1-2]研究其藥代動(dòng)力學(xué)變化。目前已報(bào)道的咪達(dá)唑侖血藥濃度測定方法，流動(dòng)相制備復(fù)雜，血漿樣品處理操作煩瑣、成本高。本研究中建立了檢測大鼠血漿中咪達(dá)唑侖質(zhì)量濃度的高效液相色譜法，方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可為咪達(dá)唑侖大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究提供方法學(xué)參考。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

高效液相色譜系統(tǒng)，包括515泵、486紫外檢測器、Empower Application操作平臺(美國Waters公司);GL-20G-Ⅱ型冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。咪達(dá)唑侖對照品(宜昌人福藥業(yè)責(zé)任有限公司，批號為MD111106，含量100．8%);咪達(dá)唑侖注射液(江蘇恩華藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號20110825，規(guī)格為5 mL∶5 mg);乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號為111203)。健康SD大鼠，清潔級，雄性，體重(300±10)g，由山西省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號為SCXK(晉)2009-0001。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -水(62 ∶38，V/V);流速:1．0 mL/min;檢測波長:225 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

2．2 血漿樣品處理

冷凍血漿樣品室溫自然解凍，10 000 r/min離心5 min，取上層 200 μL 于離心管中，加內(nèi)標(biāo)(150 μg/mL 地西泮溶液)20 μL，混勻后，加提取劑500 μL(異丙醇 ∶乙酸乙酯=2∶8)，渦旋震蕩1 min，10 000 r離心處理 5 min，取上清液 500 μL，于 37 ℃水浴，氮?dú)饬鞔蹈桑?00 μL甲醇復(fù)溶，進(jìn)樣。

2．3 專屬性試驗(yàn)

取咪達(dá)唑侖對照品溶液直接進(jìn)樣，另取空白血漿、空白血漿加咪達(dá)唑侖對照品及給藥后2 h的血漿樣品，分別按2．2項(xiàng)下方法處理并測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo)物峰形良好，保留時(shí)間分別為6．7 min和8．2 min，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對咪達(dá)唑侖的測定無干擾。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取空白血漿，制備質(zhì)量濃度分別為 0．1，0．25，1，5，10，20，30 μg/mL的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，按2．2項(xiàng)下方法處理并測定。以咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，血漿藥物質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y=0．075 2 X-0．004 2，r=0．999 9(n=7)。結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖質(zhì)量濃度在0．1～30 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2．5 回收率試驗(yàn)

咪達(dá)唑侖及內(nèi)標(biāo)提取回收率:取空白血漿15份，分為3組，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理、測定，記錄峰面積。咪達(dá)唑侖峰面積與等量咪達(dá)唑侖對照品溶液直接進(jìn)樣的峰面積比值，即咪達(dá)唑侖的提取回收率在85% ～91%之間，符合要求，RSD值也均在規(guī)定范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。

表1 大鼠體內(nèi)血漿中咪達(dá)唑侖提取回收率和方法回收率試驗(yàn)結(jié)果

方法回收率:取空白血漿15份，分為3組，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理、測定，記錄峰面積。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算測得濃度與加入的理論濃度的比值即方法回收率。結(jié)果表明，低、中、高3種質(zhì)量濃度的方法回收率分別為(109．8±4．54)% ，(101．6±3．28)% 和(104．9 ±4．23)%，符合要求，結(jié)果見表 1。

2．6 精密度試驗(yàn)

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備0．25，5，20 mg/L的咪達(dá)唑侖模擬血漿樣品，按照2．2血漿樣品處理方法處理，分別于1日內(nèi)不同時(shí)間處理并測定，計(jì)算日內(nèi)精密度;于0，1，2，3，4 d處理并測定，計(jì)算日間精密度。3種質(zhì)量濃度模擬血漿樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度的 RSD值均符合要求，該方法精密度良好，結(jié)果見表2。

表2 日內(nèi)和日間精密度(n=5)

3 討論

在藥學(xué)的一般試驗(yàn)中，常規(guī)選擇200～250 g的健康大鼠，而本研究因?yàn)檫溥_(dá)唑侖藥物用量小，僅10 mg/kg給藥量，對大鼠尾靜脈注射的準(zhǔn)確性要求高，故選用了300 g左右的健康成年大鼠，目的是為減少操作失誤，保障注射劑量的準(zhǔn)確性。

近年來臨床上在鎮(zhèn)靜、抗驚厥的治療中常選擇咪達(dá)唑侖持續(xù)靜脈滴注，此途徑可使咪達(dá)唑侖濃度維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍，但長時(shí)間靜脈滴注可使其血漿半衰期顯著延長。在使用高劑量咪達(dá)唑侖作誘導(dǎo)麻醉時(shí)，藥效學(xué)方面存在較大的個(gè)體差異[3-4]。因此，研究血漿中咪達(dá)唑侖濃度測定方法具有十分重要的意義。關(guān)于血漿咪達(dá)唑侖濃度測定已有文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]，本試驗(yàn)從臨床藥物檢測角度建立了高效液相色譜法測定咪達(dá)唑侖在大鼠體內(nèi)的分布濃度，通過對大鼠體內(nèi)不同劑量給藥和檢測給藥后不同時(shí)間藥物的分布情況，取得了大量科學(xué)數(shù)據(jù)，為該藥的研究建立了簡便、準(zhǔn)確的科學(xué)分析方法。

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