四逆散對(duì)應(yīng)激性肝郁小鼠的保護(hù)作用機(jī)制研究

郭青文 ，何 銀 ，何蓉蓉

(1．江西省遂川人民醫(yī)院，江西 吉安 343900;2．暨南大學(xué)，廣東 廣州 510632)

四逆散是出自《傷寒論》的經(jīng)典名方，由柴胡、枳實(shí)、白芍、甘草按1∶1∶1∶1組成的散劑，近代醫(yī)家用作湯劑，以水煎服。四逆散是疏肝解郁、調(diào)和肝脾的組方，主治陽郁厥逆、肝脾氣郁等[1]。臨床研究表明，四逆散對(duì)肝炎、纖維化和肝硬化有較好的預(yù)防和治療效果[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，四逆散不僅有保肝作用[4]，并有較好的抗抑郁作用[5]。但關(guān)于四逆散抗抑郁與保肝作用之間的聯(lián)系并不清楚，其疏肝解郁的作用機(jī)制也不明確。本研究中利用小鼠拘束應(yīng)激負(fù)荷模型評(píng)價(jià)了四逆散湯劑的疏肝解郁作用，并通過檢測(cè)應(yīng)激性激素水平以及肝臟炎癥、氧化水平的變化探討其可能的作用機(jī)制，為四逆散的臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

試藥:四逆散是由康美藥業(yè)股份有限公司提供的柴胡、枳實(shí)、白芍、炙甘草各250 g，加10倍量水浸泡20 min、煮沸60 min、提取3次合并濾液濃縮而成(提取率為15．62%)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所;甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技有限公司產(chǎn)品;6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox，為維生素E的水溶性衍生物)、2，2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)、熒光素鈉(sodium fluorescein)均為日本和光純藥株式會(huì)社產(chǎn)品(Wako Pure Chemical Industries， Ltd，Osaka， Japan)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7～9周齡昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SCXK(粵)2008-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在清潔級(jí)層流架中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±2)℃，照明時(shí)間每日12 h(7:00-19:00)。飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

1．2 試驗(yàn)方法

拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠模型建立:將昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(C組)、應(yīng)激模型組(M)組、應(yīng)激模型＋維生素C對(duì)照組(P組)、應(yīng)激模型＋四逆散高劑量組(SH組，1 000 mg/kg)、應(yīng)激模型＋中劑量組(SL組，565 mg/kg)共5組，每組10只。小鼠連續(xù)灌胃給藥1周，試驗(yàn)第6天時(shí)給予小鼠一次性拘束應(yīng)激18 h(14:00～8:00)。期間所有小鼠禁食禁水。拘束18 h后，小鼠乙醚麻醉，心臟采血后置肝素處理的離心管中，5 000 r/min離心5 min，分離血漿儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆?。取小鼠肝臟以生理鹽水制成10%勻漿，12 000 r/min離心15 min后取上清液，用于測(cè)定生化指標(biāo)。

血漿ALT和AST測(cè)定:ALT和AST水平根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定[6]。

小鼠血漿皮質(zhì)酮(CORT)測(cè)定:將小鼠全血置肝素處理的離心管中，5 000 r/min離心5 min，分離血漿，加入適量內(nèi)標(biāo)物皮質(zhì)醇，用1．5 mL乙酸乙酯萃取，1 500 r/min離心5 min，收取上層乙酸乙酯液，下層再加1 mL乙酸乙酯萃取2遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，用0．1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL洗滌，再用1 mL蒸餾水洗滌2次，用氮?dú)獯蹈梢宜嵋阴ヒ?，?0 μL流動(dòng)相溶解樣品提取物。按Wood等[7]的方法，采用高效液相色譜(HPLC)內(nèi)標(biāo)法(內(nèi)標(biāo)物為皮質(zhì)醇)測(cè)定血漿中CORT水平。HPLC檢測(cè)條件為Hitachi高效液相色譜系統(tǒng)(包括L-6200型輸液泵、L-5020型柱溫箱、L-4000型紫外檢測(cè)器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站)，檢測(cè)波長為 254 nm，色譜柱為 5C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為38%乙腈-水，流速1 mL/min。

小鼠肝組織抗氧化能力指標(biāo)(ORAC)、MDA、一氧化氮(NO)測(cè)定:小鼠肝組織ORAC參考文獻(xiàn)[8]方法測(cè)定。小鼠肝組織的氧化損傷產(chǎn)物MDA水平采用南京建成試劑盒測(cè)定。小鼠肝組織的炎癥水平NO采用Griess法測(cè)定[9]。

小鼠肝組織SOD及GSH-Px活性測(cè)定:取10%的小鼠肝組織0．9%氯化鈉注射液勻漿液，在4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液，稀釋成1%肝組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定肝組織蛋白水平、SOD及GSH-Px活性。

小鼠肝組織皮質(zhì)酮激素受體(GR)mRNA表達(dá)測(cè)定:取肝臟組織，用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以總RNA 3 μg為模板，總反應(yīng)體系20 μL，42℃水浴1 h合成cDNA。PCR反應(yīng)條件設(shè)置，94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，60℃退火40 s，72℃延伸 50 s，72℃再延伸7 min。重復(fù)b，c，d 3步30個(gè)循環(huán)，同法以18S mRNA為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。結(jié)果以GR與內(nèi)參照物18S mRNA擴(kuò)增片段灰度值的比值(relative intensity)表示GR mRNA相對(duì)水平。PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，并以Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 13．0軟件，利用 ANOVA檢驗(yàn)和 Dunnett's檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(X ±s)表示，P ＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 對(duì)小鼠血漿ALT和AST水平的影響

結(jié)果見圖1。ALT和AST是反映肝臟炎癥程度的重要指標(biāo)。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠血漿ALT水平顯著上升，表明應(yīng)激誘發(fā)肝炎。與模型組(M組)相比，陽性藥、四逆散高中劑量均能顯著降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿ALT和AST水平(P＜0．05)。

圖1 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿ALT和AST水平的影響

2．2 對(duì)小鼠血漿CORT水平及肝臟GR表達(dá)的影響

結(jié)果見圖2和圖3。CORT是糖皮質(zhì)激素的一種，與受體GR結(jié)合后調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠血漿CORT水平顯著升高;與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿CORT水平(P＜0．05)。GR mRNA表達(dá)的強(qiáng)弱可間接反映機(jī)體皮質(zhì)激素的響應(yīng)水平。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠GR mRNA表達(dá)顯著下調(diào);與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量對(duì)應(yīng)激負(fù)荷小鼠的GR mRNA表達(dá)并無顯著影響(P＞0．05)。

圖2 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿CORT水平的影響

圖3 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠GR mRNA表達(dá)的影響

2．3 對(duì)小鼠肝組織抗氧化能力指數(shù)的影響

結(jié)果見圖4和圖5。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠肝組織ORAC值顯著降低;與M組相比，陽性藥及四逆高中劑量均能顯著升高應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織ORAC值(P＜0．05)。

圖4 肝組織ORAC指數(shù)測(cè)定示意圖

圖5 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織ORAC的影響

2．4 對(duì)小鼠肝組織MDA水平的影響

結(jié)果見圖6。MDA是衡量機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)，間接反映了細(xì)胞的損傷程度。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠肝組織MDA水平顯著上升，表明應(yīng)激對(duì)小鼠肝組織造成損傷。與M組相比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織MDA 水平(P ＜0．05)。

2．5 對(duì)小鼠肝組織NO水平的影響

結(jié)果見圖7。NO大量生成被認(rèn)為是細(xì)胞損傷一個(gè)重要原因，阻止其釋放是作為阻止炎癥損傷重要方法之一。拘束應(yīng)激負(fù)荷后，小鼠肝組織NO水平顯著升高，表明拘束應(yīng)激誘發(fā)了肝損傷。與M組對(duì)比，陽性藥及四逆散高中劑量均能顯著降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織NO水平(P＜0．05)。

圖6 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織MDA水平的影響

圖7 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織NO水平的影響

2．6 對(duì)小鼠肝組織SOD與GSH-Px活性的影響

圖8 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織SOD活性的影響

圖9 四逆散對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織GSH-Px活性的影響

3 討論

拘束應(yīng)激使動(dòng)物產(chǎn)生的綜合應(yīng)激反應(yīng)接近人的心理應(yīng)激，該模型與中醫(yī)七情學(xué)說在認(rèn)識(shí)上存在著共同點(diǎn)，可以用應(yīng)激模型來模仿人類情志致病[10]。本研究結(jié)果表明，小鼠拘束負(fù)荷18 h后血漿ALT和AST活性顯著上升，表明拘束應(yīng)激負(fù)荷造成肝臟損傷。與模型組相比，四逆散高中劑量均能顯著降低應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿ALT和AST水平，表明四逆散對(duì)應(yīng)激負(fù)荷造成的肝損傷有保護(hù)作用。在應(yīng)激下，機(jī)體為了防止炎癥反應(yīng)過激，在啟動(dòng)全身炎癥反應(yīng)的同時(shí)也啟動(dòng)內(nèi)部的抗炎效應(yīng)，其中重要的表現(xiàn)之一就是釋放大量的皮質(zhì)激素以激活GR發(fā)揮抗炎功能[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組對(duì)比，拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿CORT水平顯著上升，而GR mRNA表達(dá)下調(diào)。提示在拘束應(yīng)激負(fù)荷下，CORT與GR結(jié)合減少，甚至可能出現(xiàn)CORT抵抗，其抗炎作用得不到正常的發(fā)揮。四逆散給藥后，拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠血漿CORT水平明顯下降，而GR mRNA表達(dá)并沒有顯著性變化，這表明四逆散能降低血漿游離CORT水平，但不具有激活GR表達(dá)的藥效。四逆散可能主要是通過降低血漿CORT水平，使激素抵抗效應(yīng)減輕或消除而發(fā)揮對(duì)拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠的保肝作用。

此外，CORT與GR結(jié)合，能激活細(xì)胞內(nèi)PKA、P38絲裂素活化蛋白激酶途徑信息調(diào)控路徑，提高iNOS的表達(dá)量，從而造成細(xì)膜及線粒體DNA(mtDNA)等生理功能[14]，會(huì)造成內(nèi)源性活性氧(ROS)的大量產(chǎn)生。本研究結(jié)果也表明，拘束應(yīng)激負(fù)荷能造成小鼠肝臟NO水平大量上升。本研究進(jìn)一步以生物膜中不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物MDA水平來反映機(jī)體過氧化狀態(tài)，以O(shè)RAC值反映機(jī)體清除氧自由基的能力，進(jìn)而評(píng)價(jià)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠肝組織MDA水平顯著升高，而ORAC值明顯降低，說明拘束應(yīng)激負(fù)荷對(duì)小鼠肝組織細(xì)胞膜造成損傷，使小鼠機(jī)體肝細(xì)胞處于一種氧化損傷狀態(tài)。與模型組相比，四逆散能顯著改善因拘束應(yīng)激引起的MDA和ORAC變化，緩和機(jī)體的過氧化狀態(tài)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，拘束應(yīng)激負(fù)荷顯著降低小鼠肝組織的SOD和GSH-Px活性，表明拘束應(yīng)激負(fù)荷對(duì)肝組織的抗氧化系統(tǒng)有破壞作用，導(dǎo)致小鼠清除自由基的能力下降。四逆散給藥后，拘束應(yīng)激負(fù)荷小鼠SOD及GSH-Px活性明顯升高，表明四逆散能增強(qiáng)應(yīng)激狀態(tài)下小鼠的抗氧化能力，恢復(fù)小鼠機(jī)體的氧化與抗氧化平衡。

總之，四逆散的疏肝解郁作用可能與緩解應(yīng)激負(fù)荷引起的肝損傷有關(guān)，其保護(hù)機(jī)制與抑制應(yīng)激負(fù)荷引起的炎癥發(fā)生以及氧化損傷作用有關(guān)。

[1]陳金保．四逆散方證研究及臨床應(yīng)用規(guī)律探討[D]．北京:中國中醫(yī)科學(xué)院，2007．

[2]王付，尚立芝，苗小玲，等．四逆散加味治療肝纖維化的臨床療效觀察[J]．中醫(yī)藥通報(bào)，2012，11(1):42-43．

[3]郭曉萍，李東良，李劍鳴，等．復(fù)方四逆散對(duì)慢性肝炎肝纖維化療效的臨床病理分析[J]．中國中醫(yī)藥信息雜志，1999，6(12):49-50．

[4]王東強(qiáng)．四逆散的保肝作用及機(jī)制研究[D]．天津:天津中醫(yī)藥學(xué)院，2002．

[5]覃 朗．四逆散抗抑郁機(jī)制研究[J]．當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2010，16(14):29-30．

[6]何蓉蓉，李秋蘭，向飛軍，等．四逆散傳統(tǒng)飲片湯劑和配方顆粒對(duì)兩種因素致肝損傷模型小鼠的藥效比較[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(18):153-156．

[7]Wood WC，Emery PW．Determination of plasma corticosterone using high performance liquid chromatography[J]．Crromatogr，1988，419:28-40．

[8]續(xù)潔琨，姚新生，栗原博．抗氧化能力指數(shù)(ORAC)測(cè)定原理及應(yīng)用[J]．中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22(8):1 015-1 021．

[9]寶 麗，姚新生，何蓉蓉，等．廣東涼茶顆粒對(duì)拘束負(fù)荷誘發(fā)小鼠應(yīng)激性肝損傷的保護(hù)作用[J]．中國中藥雜志，2008，33(6):664-669．

[10]何蓉蓉，姚新生，栗原博．拘束應(yīng)激動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用[J]．中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(11):80-83．

[11]歐珠美朵，馬洪升．冷束縛應(yīng)激狀態(tài)下大鼠內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素與腸屏障功能損害的關(guān)系[J]．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(3):2 610-2 614．

[12]Cuong TT，Yang CS，Yuk JM，et al．Glucocorticoid receptor agonist compound K regulates dectin-1-dependent inflammatory signaling through inhibition of reactive oxygen species[J]．Life Sciences，2009，85(17-18):625-633．

[13]Lenzen S，Lortz S，Gurgul-Convey E．Nitrooxidative stress as a mechanism of cytokine-mediated toxicity in insulin-producing cells[J]．Diabetologia，2009，52:S150-S150．

[14]Cuperus R，Leen R，Tytgat GAM，et al．Fenretinide induces mitochondrial ROS and inhibits the mitochondrial respiratory chain in neuroblastoma[J]．Cellular and Molecular Life Sciences，2010，67(5):807-816．