高效液相色譜法測(cè)定蓮膽消炎片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量

陸 瀅

（江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科臨床藥學(xué)室，江蘇 鹽城 224000）

蓮膽消炎片由穿心蓮和苦木組方，功效為清熱解毒、涼血消腫，用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、口舌生瘡、頓咳勞嗽、熱淋澀痛[1]。根據(jù)1995年版《中國藥典》1997年增補(bǔ)版本中對(duì)蓮膽消炎片的標(biāo)準(zhǔn)，在其檢查項(xiàng)中只對(duì)穿心蓮內(nèi)酯作了規(guī)定（即要求每片含總內(nèi)酯以穿心蓮內(nèi)酯計(jì)，不得少于18 mg），未對(duì)脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量作出規(guī)定，這樣不易于對(duì)蓮膽消炎片的質(zhì)量進(jìn)行有效控制[2]。筆者認(rèn)為，可根據(jù)2010年版《中國藥典(一部)》中對(duì)穿心蓮的質(zhì)量要求，建立用于蓮膽消炎片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定的高效液相色譜法，從而控制蓮膽消炎片的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相測(cè)定儀；G1314B型紫外檢測(cè)器；Agilent色譜工作站；BP 211D型電子天平；TB224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為110797-200307），脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為 110854-200306）均來自中國藥品生物制品檢定所；蓮膽消炎片（批號(hào)分別為 20100101，20100309，20100716，20101103，20101201，江西恒康藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent C18柱（150 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 - 水（52 ∶48）；穿心蓮內(nèi)酯的流速：0．8 mL ／min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長：225 nm；脫水穿心蓮內(nèi)酯的流速：0．8 mL／min，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長：254 nm。理論板數(shù)按穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)算均應(yīng)不低于2 000。

2．2 溶液制備

分別取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含0．1 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液（貯備液）[3]。取蓮膽消炎片10片除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取適量，精密稱定1．0 g，置三角瓶中，精密加入40%的甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，浸泡 1 h，超聲處理（功率 250 W，頻率 33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用40%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱（200到300目，5 g，內(nèi)徑為1．5 cm），用甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取不含穿心蓮的模擬制劑制備的陰性對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，在與穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液峰相同位置，供試品溶液有色譜峰出現(xiàn)，色譜峰與其相鄰峰能完全達(dá)到基線分離。陰性對(duì)照品溶液在穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮峰相應(yīng)位置無干擾。高效液相色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液（貯備液）適量共5份，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容，使質(zhì)量濃度分別稀釋 2，4，8，80倍，將上述 5份溶液和原對(duì)照品貯備液各精密量取10 μL注入色譜柱。以穿心蓮內(nèi)酯峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 C=26．395 030 12 A-13．301 027 15， r=0．999 9。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量在5～400 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。平均回收率為97．74%。精密量取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液（貯備液）適量共5份，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋定容，使質(zhì)量濃度分別稀釋 2，20，100，500倍，上述 5份溶液和原對(duì)照品貯備液各精密量取 10 μL注入色譜柱。以脫水穿心蓮峰面積(A)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回 歸，得 回歸方程 C=17．341 648 01 A＋9．001 333 10，r=0．999 9。結(jié)果表明，脫水穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)樣量在 3～1 535 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，分別連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次。結(jié)果穿心蓮內(nèi)酯RSD為0．9%，脫水穿心蓮內(nèi)酯的 RSD為0．7%，表明該方法的精密度良好。

檢測(cè)限考察：取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液（0．1 g／L）逐步稀釋，在 S／N=10時(shí)，穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)限約為 0．5 ng。取脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液（0．08 g／L）逐步稀釋，在 S ／N=10 時(shí)，脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)限約為3．2 ng。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取含穿心蓮內(nèi)酯0．100 9 g／L的對(duì)照品溶液，按擬訂方法操作，隔4 h測(cè)1次，共測(cè)5次，計(jì)算含量，結(jié)果的日內(nèi) RSD為0．47%。另取上述不同質(zhì)量濃度的溶液，同法處理，周內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，日間 RSD為0．89%。精密量取含脫水穿心蓮內(nèi)酯0．003 2 g／L的對(duì)照品溶液，按擬訂方法操作，隔4 h測(cè)1次，共測(cè)5次，計(jì)算含量，結(jié)果的日內(nèi) RSD為0．39%。另取上述不同質(zhì)量濃度的溶液，同法處理，周內(nèi)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果的日間RSD 為 0．91%。

2．4 樣品含量測(cè)定

分別精密量取處理好的樣品溶液10 μL注入色譜柱，測(cè)得樣品中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蓮膽消炎片中穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，見表1。樣品測(cè)定結(jié)果表明，蓮膽消炎片中穿心蓮內(nèi)酯在穿心蓮中的含量為1．39%，脫水穿心蓮內(nèi)酯在穿心蓮中的含量為1．97%。該值符合2010年版《中國藥典(一部)》限定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯在穿心蓮的含量不得少于0．8%的規(guī)定。

表1 蓮膽消炎片含量測(cè)定結(jié)果（n＝6）

3 討論

穿心蓮的有效成分為二萜內(nèi)酯類和黃酮類化合物，主要有穿心蓮內(nèi)酯，脫水穿心蓮，新穿心蓮內(nèi)酯，去氧穿心蓮內(nèi)酯等成分[4]，具有細(xì)胞分化誘導(dǎo)、保肝降酶作用[5]，提高膽汁分泌量，并改變其物理特性等藥理作用[6]。試驗(yàn)中收集了不同產(chǎn)地的穿心蓮藥材，并對(duì)其中的脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，除超聲時(shí)間增加到60 min外，測(cè)定方法和制劑測(cè)定方法都相同。用本法測(cè)定的5批藥材的結(jié)果與1995年版《中國藥典》中收載的薄層掃描測(cè)定結(jié)果比較，兩種方法測(cè)定的結(jié)果差異不大。而不同批號(hào)藥材的測(cè)定結(jié)果差異較大，鑒于大生產(chǎn)中的原材料受產(chǎn)地、來源、品種等因素的影響，使得制劑測(cè)定結(jié)果有較大差異，故對(duì)穿心蓮材料中脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量應(yīng)該做限度規(guī)定[7]。

脫水穿心蓮內(nèi)酯易于溶解在有機(jī)溶劑中，對(duì)比了甲醇、乙醇和醋酸乙酯的提取效果，甲醇的提取所測(cè)得的含量高，故選用甲醇作為提取溶劑。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[8]，以乙酸乙酯、甲醇為溶劑提取進(jìn)行比較，結(jié)果因甲醇提取時(shí)間短，測(cè)定時(shí)雜質(zhì)峰干擾少，故以甲醇提取時(shí)含量測(cè)定方法的回收率高、精密度好，重現(xiàn)性也好。

穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯分子極性較強(qiáng)，比較適合用于高效液相色譜分析，常用的流動(dòng)相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系統(tǒng)、甲醇-水-氯仿 -二乙胺系統(tǒng)和甲醇-水-乙腈系統(tǒng)等。根據(jù)本品情況及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，甲醇可以滿足穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯與雜質(zhì)峰的分離，且得到較好的峰形。故選擇了甲醇-水溶液（52∶48）作為流動(dòng)相，得到了較好的分離效果。

文獻(xiàn)報(bào)道穿心蓮內(nèi)酯在200～250 nm波長處有較大吸收[9]，用紫外分光光度與200～400 nm處掃描穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品溶液，結(jié)果顯示在225 nm處有最大吸收峰，極限也較穩(wěn)定。同樣，脫水穿心蓮內(nèi)酯在254 nm處測(cè)定效果最佳。

有文獻(xiàn)報(bào)道，穿心蓮貯存年份越久，穿心蓮內(nèi)酯的含量則越低[10]。存放1年后，穿心蓮內(nèi)酯的含量可降低 50% ～80%。但另1篇文獻(xiàn)報(bào)道，將新采收的穿心蓮葉曬干并室溫存放1年后，再測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯的含量，結(jié)果與新采收時(shí)的含量基本一樣，沒有降低[11]。兩種方法提示，穿心蓮內(nèi)酯含量的降低可能與其水分的含量成正比，這還需深入研究。

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