RNAi在成體干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

項(xiàng) 煒，安榮澤，王兆杰 [遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院骨外科，廣東 珠海 519000]

RNAi（RNA interference）是普遍存在于自然界中的基因沉默現(xiàn)象，是近些年才發(fā)現(xiàn)并迅速發(fā)展起來的一門新興的基因阻斷技術(shù)，RNAi是一種強(qiáng)有效的抑制基因表達(dá)的工具，以高度特異性、高效性、作用迅速以及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)受到分子生物學(xué)研究者們青睞，該技術(shù)由Andrew Fire和Craig Mello在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，已廣泛應(yīng)用于基因功能的研究、抗腫瘤以及各種疾病的研究中[1]。

1 成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞是一種具有自我更新、不斷增殖和組織特異性定向分化潛能的一類細(xì)胞，曾認(rèn)為其再生和分化潛能是比較局限的，然而當(dāng)成體干細(xì)胞的“可塑性”被提出后，這種潛能低的觀點(diǎn)受到抨擊。Blau表明擴(kuò)展成體干細(xì)胞的傳統(tǒng)概念是必要的，他們提出成體干細(xì)胞的新概念，認(rèn)為成體干細(xì)胞存在于不同類型的組織中，是一種細(xì)胞狀態(tài)，而且可以通過血液循環(huán)到達(dá)機(jī)體各處，參與組織的修復(fù)和再生[2]。目前發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞主要有造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。另外還有肝臟干細(xì)胞，毛囊來源性干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等[3-4]。

2 RNAi在成體干細(xì)胞中的應(yīng)用

近些年，RNAi高效、特異的基因沉默作用，激發(fā)了科研工作者們對(duì)其應(yīng)用前景的探索。目前該技術(shù)在細(xì)胞水平上的研究已取得了巨大成功，在成體干細(xì)胞方面也有許多成功的試驗(yàn)。Low等指出在生物醫(yī)學(xué)中，引導(dǎo)或促進(jìn)干細(xì)胞分化方面，RNAi是一種重要技術(shù)手段[5]。

3 RNAi在造血干細(xì)胞中的應(yīng)用

造血干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cells，HSCs）是造血細(xì)胞的“種子”，體內(nèi)所有的血細(xì)胞都由它分化而來。存在于骨髓外周血臍帶血中，可以轉(zhuǎn)變成肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，或在肌肉組織中分化為有成熟肌肉細(xì)胞表型的細(xì)胞等，還可隨血液流動(dòng)進(jìn)入全身各個(gè)組織中補(bǔ)充各種組織中成體細(xì)胞的不足，HSCs又是一個(gè)基因治療的理想靶細(xì)胞[6]。

隨著HSCs分離、純化和體外培養(yǎng)技術(shù)的日趨成熟，以HSCs為靶細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移已成為基因功能研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。Gupta構(gòu)建了以病毒為載體，帶有綠色熒光蛋白（GFP），用以沉默人腎母細(xì)胞過度表達(dá)基因序列（Nephroblastoma Overexpressed，Nov/CCN3）的短發(fā)夾RNA（shRNA），在轉(zhuǎn)染至HSCs后第7天，通過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Nov/CCN3表達(dá)明顯減少，HSCs在體內(nèi)外的功能均喪失[7]；然而，加強(qiáng)Nov/CCN3基因表達(dá)卻可增強(qiáng)HSCs增值分化的活性，以此實(shí)驗(yàn)證明了Nov/CCN3基因是HSCs增值分化關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因。為了提高HSCs的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，許多學(xué)者在載體方面做研究，Papadaki首次以泡沫病毒（Foamy virus，F(xiàn)V）為載體，將帶有小鼠mU6和人類H1聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子的序列在體外分別轉(zhuǎn)染到人和小鼠的HSCs中，經(jīng)骨髓移植至小鼠體內(nèi)進(jìn)行觀察，兩者均十分有效地沉默了目的基因，并表明FV作為載體在HSCs中高轉(zhuǎn)染率及其高度穩(wěn)定性[8]。Martino實(shí)驗(yàn)表明，HSCs在定向分化成樹突狀細(xì)胞時(shí)，運(yùn)用RNAi技術(shù)，通過陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTAP轉(zhuǎn)染法沉默組織蛋白酶S基因（Cathepsin S，CatS），可影響HSCs成樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，而且具有轉(zhuǎn)染率高，毒性比病毒載體低的優(yōu)點(diǎn)[9]。

4 RNAi在神經(jīng)干細(xì)胞中的應(yīng)用

神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells，NSCs）是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細(xì)胞，它可以通過不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞，NSCs的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)元不會(huì)再生的傳統(tǒng)觀念。近年來人們對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)基因基礎(chǔ)有了新的認(rèn)識(shí)，NSCs的臨床應(yīng)用與基因治療的有機(jī)結(jié)合，為多種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性和獲得性疾病的治療開辟了一條嶄新的途徑[10]。

NSCs可在體外培養(yǎng)且根據(jù)不同需要導(dǎo)入外源基因，是一種廣譜的細(xì)胞載體，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染均存在轉(zhuǎn)染率的問題，而干細(xì)胞更是比較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之一，構(gòu)建高轉(zhuǎn)染率載體是必要的，張蓬勃構(gòu)建針對(duì)小鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α基因（HIF-1α）的siRNA腺病毒載體AdHIF-1α-shRNA-EGFP，體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的小鼠前腦皮質(zhì)NSCs，實(shí)驗(yàn)證明腺病毒載體能較高效率地轉(zhuǎn)染小鼠胚胎NSCs并能有效抑制低氧條件下HIF-1α的表達(dá)[11]。學(xué)者們以RNAi技術(shù)基因沉默NSCs的相關(guān)基因，觀察基因沉默后對(duì)NSCs分化方面的影響也進(jìn)行了研究。王東等在顱腦損傷的研究中表明，通過RNAi技術(shù)，暫時(shí)性封閉NSCs中的NgR基因，再通過立體定向的方法準(zhǔn)確移植到大鼠顱腦損傷區(qū)，移植的NSCs可以更好的在損傷部位存活，增殖分化與遷移，促進(jìn)腦外傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，通過構(gòu)建siRNA沉默NSCs中的RE1沉默轉(zhuǎn)錄因子（REST），調(diào)整REST水平，不僅可以控制NSCs的分化，而且可以使得一些涉及復(fù)雜分子機(jī)制的神經(jīng)細(xì)胞功能被激活，如神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)等[5]。

5 RNAi在間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSCs最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，隨后還發(fā)現(xiàn)存在于人體發(fā)生、發(fā)育過程的許多種組織中。目前，我們能夠從骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中分離和制備間充質(zhì)干細(xì)胞。

RNAi技術(shù)應(yīng)用于MSCs的相關(guān)研究較多。Suehiro等利用相關(guān)的siRNA分別沉默MSCs中的ZHX3，RUNX2和Osterix基因，對(duì)比三者間影響MSCs的成骨能力，實(shí)驗(yàn)表明ZHX3基因在MSCs成骨細(xì)胞分化能力可與RUNX2和Osterix基因相媲美，以此推斷ZHX3是MSCs成骨分化的關(guān)鍵因子[13]。有研究顯示，通過脂質(zhì)體法將PTEN基因特異的siRNA轉(zhuǎn)染入骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），PTEN基因的沉默能有效地促進(jìn)BMSCs的增殖，使細(xì)胞周期向右偏移，同時(shí)能抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受能力[14]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，PTEN基因沉默后的BMSCs更容易在心肌梗死區(qū)域存活和增殖，為干細(xì)胞移植治療心肌梗死提供新的思路。我國(guó)在胎盤和臍帶來源的MSCs方面研究在世界上處于前列，陳奎通過RNAi技術(shù)下調(diào)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）中HLA-A2基因表達(dá)，可能是RNAi的高特異性和靶序列的選擇性，siRNA只特異地沉默了其相應(yīng)靶基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HLA-A2基因的沉默并不影響hUCMSCs成骨細(xì)胞的分化[15]。

6 展望

成體干細(xì)胞在特定的環(huán)境或誘導(dǎo)作用下分化產(chǎn)生新的目的細(xì)胞，不存在道德問題，將成為醫(yī)學(xué)研究中首選的種子細(xì)胞，但成體干細(xì)胞向多種組織分化用于治療的路程可能還很漫長(zhǎng)，而RNAi技術(shù)具有巨大的應(yīng)用前景，通過成體干細(xì)胞和RNAi技術(shù)兩者的相結(jié)合，研究決定細(xì)胞發(fā)育特定基因的功能，通過沉默目的基因，進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)和基因調(diào)控，可暫時(shí)性抑制細(xì)胞內(nèi)某段基因而不是永久敲除，為成體干細(xì)胞研究的可操作性提供一個(gè)完美的技術(shù)手段。利用RNAi技術(shù)特異性抑制成體干細(xì)胞維持或定向分化研究，對(duì)進(jìn)行疾病治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，RNAi和成體干細(xì)胞研究尚處于初級(jí)階段，但兩者的結(jié)合已顯示出巨大的應(yīng)用潛力?？傊?，RNAi的應(yīng)用將為成體干細(xì)胞研究開辟一條全新的途徑。

[1] Mello CC,Conte DJ.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004,431(7006):338.

[2] Blau HM,Brazelton TR,Weimann JM.The evolving concept of a stem cell:entity or function[J].Cell,2001,105(7):829.

[3] Snippert HJ,Clevers H.Tracking adult stem cells[J].EMBO Rep,2011,12(2):113.

[4] Hodgkinson T,Yuan XF,Bayat A.Adult stem cells in tissue engineering[J].Expert Rev Med Devices,2009,6(6):621.

[5] Low WC,Yau WW,Stanton LW,et al.Directing neuronal differentiation of primary neural progenitor cells by gene knockdown approach[J].DNA Cell Biol,2012,31(7):1148.

[6] 李玉艷,梁志清,史常旭.造血干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2009,30(4):355.

[7] Gupta R,Hong D,Iborra F,et al.NOV(CCN3)functions as a regulator of human hematopoietic stem or progenitor cells[J].Science,2007,316(5824):590.

[8] Papadaki M,Siapati EK,Vassilopoulos G.A foamy virus vector system for stable and efficient RNAi expression in mammalian cells[J].Hum Gene Ther,2011,22(10):1293.

[9] Martino S,Girolamo I,Tiribuzi R,et al.Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells[J].J Biomed Biotechnol,2009,20(9):410.

[10] Kim SU.Genetically engineered human neural stem cells for brain repair in neurological diseases[J].Brain Dev,2007,29(4):193.

[11] 張蓬勃,李衛(wèi)松,李 旭,等.抑制小鼠低氧誘導(dǎo)因子-1α基因的小干擾RNA腺病毒載體的構(gòu)建和功能鑒定[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2011,32(6):642.

[12] 王 東,張建軍,馬景鑑.神經(jīng)干細(xì)胞NgR基因沉默立體定向移植治療大鼠腦損傷[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(14):2539.

[13] Suehiro F,Nishimura M,Kawamoto T,et al.Impact of zinc fi ngers and homeoboxes 3 on the regulation of mesenchymal stem cell osteogenic differentiation[J].Stem Cells Dev,2011,20(9):1539.

[14] 雷 瑩,陳 杭,許 紅,等.PTEN基因的沉默對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生物學(xué)特性和體內(nèi)移植治療心肌梗死的影響[J].臨床心血管病雜志,2011,27(4):307.

[15] 陳 奎,秦書儉.siRNA沉默HLA-A2基因表達(dá)對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨的影響[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(5):413.