ELISA法篩查梅毒抗體假陽性結(jié)果分析及應(yīng)對措施

韓曉峰，劉 蔚，李素君，葉 琴，劉孫琴（武漢科技大學附屬天佑醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430064）

梅毒是蒼白密螺旋體亞種（又名梅毒螺旋體）感染人體所引起的一種古老的、性傳播疾病，可侵犯全身各臟器，引起人體多組織器官的損害和病變，導致功能障礙。近年來梅毒發(fā)病率呈逐步上升趨勢[1]。梅毒血清學試驗陽性者中，有些確實是梅毒感染者，但有一部分沒有診斷梅毒的任何依據(jù)。據(jù)報道：梅毒血清學試驗假陽性率為2.08%[2]。梅毒檢測結(jié)果的正確與否一直是十分敏感的醫(yī)學和社會問題，對患者工作和家庭的穩(wěn)定具有極大的影響，錯誤的檢測結(jié)果是許多醫(yī)療糾紛的起因。臨床上診斷梅毒主要是根據(jù)臨床癥狀和梅毒兩類血清學試驗，一類血清學試驗是非梅毒螺旋體抗體試驗，檢測非特異性抗心磷脂抗體，有快速血漿反應(yīng)素試驗（RPR），甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）等，主要用于梅毒的初篩和療效觀察；另一類血清學試驗為梅毒螺旋體抗體血清學試驗，檢測梅毒螺旋體特異性抗體，有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試（TPPA）、免疫印跡試驗、熒光密螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）等。TP-ELISA法因其對IgG和IgM都具有很好的檢測能力，靈敏度高、價格低廉、操作方便，因此被廣泛使用[2]。但TP-ELISA有假陽性，特別是對老年人假陽性偏高[3]。TPPA方法是目前國內(nèi)的確認方法，但據(jù)報道TPPA法存在不確定結(jié)果和1%～ 2%生物學假陽性率[4-5]。WB也是一種很好的確認方法，作為金標準試驗，對TP-ELISA法篩查出的陽性結(jié)果進行分析，建立排除假陽性結(jié)果的應(yīng)對措施[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2008年3月～2009年3月期間住院和門診患者共6317例。ELISA法檢出梅毒螺旋體抗體（TP-Ab）陽性的血清標本106例，老年組（≥60歲）62例陽性，中青年組（＜60歲）44例陽性，分離血清后，加蓋保存于-40℃冰箱。

1.2 試劑：ELISA試劑是上?？迫A生物工程股份有限的產(chǎn)品；TPPA試劑是日本富士瑞必歐株式會社的產(chǎn)品；WB試劑是德國歐蒙醫(yī)學試驗診斷有限公司的產(chǎn)品，試劑都在有效期內(nèi)。

1.3 儀器：酶標儀和洗板機均為上?？迫A試驗系統(tǒng)公司的KHB ST-360型；DY-B2脫色搖床。

1.4 方法：操作步驟嚴格按試劑說明書進行。ELISA法結(jié)果判斷是根據(jù)樣品OD≥2.1×陰性對照平均OD值，為陽性結(jié)果；TPPA法是凝集時的最高稀釋倍數(shù)為陽性報告；WB法在印跡膜上出現(xiàn)針對分子量47、45、17、15 KDa的一條或一條以上相應(yīng)的多肽抗原條帶時，判為陽性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

從6317例標本中，ELISA法檢出106例陽性；老年組（≥60歲）62例陽性，中青年組（＜60歲）44例陽性。在老年組中，TPPA法確認60例陽性，假陽性率為3.22%（2/62）；WB法確認58例陽性，假陽性率為6.45%（4/62），WB法與TPPA法檢出假陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.701，P＞0.05）。在中青年組中，TPPA確認43例陽性，假陽性率2.27%（1/44）；WB確認42例陽性，假陽性率4.55%（2/44），WB法與TPPA法檢出假陽性率的差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.173，P＞0.05）。

3 討論

在檢測梅毒螺旋體抗體試驗中，ELISA方法的敏感性達100%，該試驗是使用基因工程方法制備的混合抗原（17 KDa、47 KDa）包被微孔板，用雙抗原夾心法測定梅毒螺旋體特異性抗體[7]。因使用基因工程方法制備的重組抗原代替以往使用的野生型梅毒螺旋體抗原后，易于純化，極大提高了試驗的敏感性和特異性，操作又簡便，所以在臨床上得到廣泛使用。TPPA采用的是純化的致病性梅毒螺旋體抗原，包被在人工載體明膠顆粒是，主要用于篩查陽性標本的確診，是近年來臨床常用的梅毒螺旋體確認試驗，也是被美國疾病預防控制中心（CDC）定為確診方法之一。有研究明白TPPA法的敏感性、特異性分別為94.4%、91.1%，與熒光密螺旋體抗體吸收試驗法的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明TPPA法具有較高的特異性和敏感性，是一種比較好的梅毒血清學檢測的確認方法[8]。

WB法是一種診斷梅毒感染的特異性試驗，該試驗是在凝膠電泳和固相免疫電泳測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于它具有高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。當血清中存在梅毒特異性抗體時，則在印跡膜相應(yīng)的特異性多肽抗原位置出現(xiàn)顯色條帶。分子量為47、45、17、15 KDa的蛋白為梅毒螺旋體外膜的脂蛋白，具有較好的免疫活性[9]。印跡膜上出現(xiàn)針對分子量為47、45、17、15 KDa的一條或一條以上相應(yīng)的多肽抗原條帶時，均能判斷結(jié)果為陽性。有研究表明：因WB法優(yōu)于FTA-ABS和TPPA等法，其對二期梅毒、早期梅毒、神經(jīng)梅毒具有100%的陽性診斷率，對使用RPR、FTA-ABS、和TPPA等試驗出現(xiàn)的假陽性血清標本，用本法均為陰性，是一種很好的確認試驗。

TP-ELISA篩查梅毒血清學試驗出現(xiàn)假陽性是有其生物學基礎(chǔ)的，而且老年人假陽性率（15.38%）高于非老年組（4.62%），有可能的原因是：①某些基礎(chǔ)疾病使機體釋放誘導產(chǎn)生抗類脂抗體和抗梅毒螺旋體的交叉抗原；②某些患者體內(nèi)可能有其他螺旋體共生，誘導產(chǎn)生抗屬、群或科特異抗原的交叉反應(yīng)抗體；③目前TP試驗所用的市售商品試劑盒中，除FTA-ABS配有吸收劑外，其他如TPPA、ELISA等均未配置吸收稀釋劑，待測血清均未用吸收劑吸除與非梅毒螺旋體交叉反應(yīng)的抗體。有報道：老年人容易出現(xiàn)免疫功能異常，產(chǎn)生一些針對聯(lián)接用的清蛋白抗體或是一些異常蛋白質(zhì)干擾了TPPA的凝集反應(yīng)也可能是因為老年人常伴有心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤及白血病等慢性疾病，產(chǎn)生交叉性梅毒抗體成分而發(fā)生交叉反應(yīng)[10]。

TP-ELISA法造成假陽性的原因很多，包括方法本身因素、生物學因素、技術(shù)性因素，除提高檢驗人員素質(zhì)，解決技術(shù)性因素外，選擇特異性更高的方法來確認陽性結(jié)果。由于TP-ELISA法敏感度高，初篩試驗用此方法，保證不漏檢，不出現(xiàn)假陰性。本試驗ELISA法初篩的陽性率為1.68%（106/6317），將陽性標本分成老年組（62例）和中青年組（44例）。因TPPA是國內(nèi)公認的確認試驗，TPPA確認老年組假陽性率為3.22%（2/62），中青年組假陽性率為2.27%（1/44），TPPA法檢出的假陽性率老年組高于中青年組；用WB法確認老年組假陽性率為6.45%（4/62），中青年組假陽性率為4.55%（2/44），WB法檢出的假陽性率也是老年組高于中青年組。在老年組中，WB法檢出的假陽性率高于TPPA法，但兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.701，P＞0.05）；在青年組中，WB法檢出的假陽性率也是高于TPPA法，但兩者差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.173，P＞0.05）。TPPA試驗雖然為確認方法，但實踐中的特異反應(yīng)性為98%～100%，并不是所有TPPA陽性結(jié)果都是梅毒患者，TPPA陽性結(jié)果必須結(jié)合臨床癥狀或做免疫印跡、梅毒暗視野（DFT）檢查或其他檢測才能最后確認[11]。

基于以上分析，TP-ELISA適用于批量篩查，對缺乏臨床癥狀和病史的患者標本進行特異性較高的TPPA確認試驗，有疑問的標本進一步用WB來確認[12]。雖然確認試驗操作復雜，成本高，但能排除假陽性造成的嚴重后果，避免了醫(yī)療糾紛，不失為非常有價值的試驗方案。

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