分泌吲哚乙酸洽草內(nèi)生細菌的篩選及其對種子發(fā)芽的影響

王辰月　陳秀蓉　楊成德

摘要：從分離的31株洽草內(nèi)生細菌中篩選出3株具有較強的IAA分泌功能的內(nèi)生細菌QS3，QG3和QS15，用其稀釋過的培養(yǎng)液對苜蓿、紅三葉、燕麥、黑麥草浸種，測定了供試牧草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、胚根長度等指標，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率平均提高了5%～15%，胚根長度較對照也均增加，且差異顯著（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細菌；分泌吲哚乙酸；發(fā)芽

中圖分類號：Q 936 文獻標識碼：A 文章編號：10095500（2013）01002104

目前，植物內(nèi)生細菌對植物生長的促進作用主要分為兩方面：一方面，植物內(nèi)生細菌可通過產(chǎn)生植物生長物質(zhì)（植物生長素、赤霉素、細胞激動素等）促進植物生長；另一方面，植物內(nèi)生細菌也可通過自身的固氮、溶磷以及對不同植物病原菌的拮抗作用或者通過增強植物對礦物質(zhì)利用的有效性間接的促進植物生長＼[1-5＼]。研究結(jié)果顯示，內(nèi)生細菌在增加植株株高、干重、提高根莖重量以及增強植株生長勢等方面均有明顯的促進作用。有研究者分別從油菜的根和莖中進行了內(nèi)生細菌的分離工作，并用其中7株分離物的菌懸液處理油菜和番茄的種子，發(fā)現(xiàn)供試菌株能不同程度地提高油菜和番茄種子的萌發(fā)速度、增加幼苗的長度＼[6＼]。何紅等＼[7＼]在研究BS1和BS2菌株對辣椒和白菜的促生作用機制時發(fā)現(xiàn)，用菌株培養(yǎng)液浸種后，可使植株體內(nèi)生長素（IAA）、赤霉素（GA3）等植物內(nèi)源激素含量增加，脫落酸（ABA）含量減少。因此，篩選具有IAA分泌能力的植物內(nèi)生細菌，為開發(fā)利用高寒草地植物內(nèi)生細菌資源，以及進一步研發(fā)生物菌肥等提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試31株內(nèi)生細菌均分離自東祁連山高寒草地優(yōu)勢禾本科洽草（Koeleria cristata）。

1.1.2 儀器及試劑 臺式高速冷凍離心機、S2000型分光光度計、IOC402.XXI.C型控溫振蕩器、各種微量移液器（Biometra公司）。

PC比色液：稱取12 g FeCl3溶于300 mL蒸餾水，緩慢加入429.7 mL 98%的H2SO4，冷卻后將溶液定容至1 L，該比色液測定值為0.3～20 μg/mL。

S2比色液：稱取4.5 g FeCl3溶于300 mL蒸餾水，緩慢加入587.4 mL 98% 的H2SO4，冷卻后將溶液定容至1 L，該比色液測定值為5～200 μg/mL，超過100 μg/mL時就應(yīng)稀釋。

1.1.3 培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基用于洽草內(nèi)生細菌的分離；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于菌種的純化和保存；King氏培養(yǎng)基用于分泌IAA內(nèi)生細菌的篩選及定量測定。

1.2 實驗方法

1.2.1 洽草內(nèi)生細菌的分離 先將植物樣品用清水洗凈，去除植物體表面的土壤及雜質(zhì)，后將多余水分風(fēng)干，稱取植物樣品2 g，采用高寒草地牧草內(nèi)生細菌分離的優(yōu)化方法進行植物樣品表面的消毒和內(nèi)生細菌的分離＼[8＼]。植物樣品表面消毒后，在無菌條件下將植物樣品研碎，吸取200 μL植物組織液，涂布于TSA培養(yǎng)基上，置于28 ℃下培養(yǎng)數(shù)日，待菌落長出后，純化分離的菌種并保存。

1.2.2 分泌IAA內(nèi)生細菌的初步篩選 將從洽草內(nèi)分離出的內(nèi)生細菌菌株采用Salkowski比色法進行初步篩選＼[9＼]，然后，對篩選出的具有IAA分泌能力的菌種進行定量測定。

1.2.3 分泌IAA內(nèi)生細菌的定量測定 采用分析純3IAA配制兩組標準溶液，第1組標準溶液濃度（mg/L）依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5；第2組標準溶液濃度（mg/L）依次為25，50，75，100，125，150，175 mg/L。吸取2 mL第1組標準液，加入等量的PC比色液；吸取2 mL第2組標準液，加入等量的S2比色液，都于室溫下黑暗處靜置30 min，然后立即用分光光度計測定D530 nm值，每濃度梯度3個重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)。以標準溶液濃度為橫坐標，每濃度梯度對應(yīng)的D530 nm值為縱坐標，分別繪制PC比色液及S2比色液的標準曲線。

1.2.4 菌株分泌IAA能力的定量測定 將篩選出的具有IAA分泌能力的菌株活化培養(yǎng)后接種到King氏培養(yǎng)基中，獲得其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液離心（10 000 r/min）10 min，吸取適量上清液加入等量比色液，室溫下避光靜置30 min，立即用分光光度計測定相應(yīng)的D530 nm值，記錄數(shù)據(jù)，選用相應(yīng)的標準曲線計算出待測菌株所分泌的IAA的量，根據(jù)PC比色液和S2比色液所測定的濃度范圍確定待測菌株分泌IAA的量。

1.2.5 分泌IAA內(nèi)生細菌對植物種子發(fā)芽的影響 供試草種選用苜蓿、紅三葉、黑麥草和燕麥，測定供試植物種子的千粒質(zhì)量。將篩選出的3株具有較好IAA分泌能力的內(nèi)生細菌活化后接種在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液以1∶50的比例稀釋，用稀釋好的培養(yǎng)液浸泡供試植物種子12 h，將處理后的種子用紙上發(fā)芽法置于室溫下培養(yǎng)數(shù)日，每處理3個重復(fù)，每發(fā)芽床50粒種子，分別統(tǒng)計并測定不同種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率＼[10＼]及胚根長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 洽草內(nèi)生細菌的分離

實驗從洽草共分離出內(nèi)生細菌31株，其中，根內(nèi)11株，莖和葉內(nèi)共分離出20株。

2.2 分泌IAA內(nèi)生細菌的初步篩選

用Salkowski比色法初步篩選后，共得到5株具有IAA分泌能力的內(nèi)生細菌。

2.3 分泌IAA內(nèi)生細菌的定量測定

2.3.1 比色標準曲線（圖1）

2.3.2 菌株分泌IAA的定量測定 根據(jù)細菌在產(chǎn)生IAA過程中是否有色氨酸作為前體物質(zhì)，把細菌產(chǎn)生IAA的途徑分為色氨酸途徑和非色氨酸途徑。實驗結(jié)果表明（表1），供試菌株中QS3、QG3、QS15和XB3都為非色氨酸途徑，只有菌株QA1為色氨酸途徑。且供試菌株分泌IAA的能力較弱，濃度都低于20 mg/L。

2.4 分泌IAA內(nèi)生細菌對植物種子發(fā)芽的影響

從種子千粒質(zhì)量測定結(jié)果可以看出，供試種子品質(zhì)較好，種粒較飽滿，種子的品質(zhì)不應(yīng)作為影響發(fā)芽實驗的主要因素。

實驗結(jié)果表明，供試植物種子用適當(dāng)濃度的菌液浸種后，與對照相比，發(fā)芽勢、發(fā)芽率均有不同程度的提高，發(fā)芽種子的胚根長度有所增長。且不同菌株間對供試植物種子的促生作用也有所差異，菌株QS3與QG3的促生作用與菌株QS15相比，差異顯著（P<0.05），但并未發(fā)現(xiàn)供試菌株培養(yǎng)液對植物種子發(fā)芽的影響有明顯的專一性，雖然豆科種子苜蓿、紅三葉，禾本科種子燕麥、黑麥草的生長特性均有所優(yōu)化。

3 討論

3.1 洽草內(nèi)生細菌的分離

植物樣品表面消毒效果的優(yōu)劣直接影響了所分離內(nèi)生細菌種類及數(shù)量的多少，消毒時間過短，消毒不夠徹底，會導(dǎo)致植物體表面的微生物無法徹底除去；消毒時間過長，會將植物體內(nèi)的部分內(nèi)生菌殺死，分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量和種類減少，造成對內(nèi)生細菌多樣性的錯誤統(tǒng)計，同時，在后期篩選過程中，供試菌種數(shù)量減少。正確選擇消毒劑并確定合適的消毒時間可以分離得到種類較為豐富的內(nèi)生細菌。目前，常用的消毒劑為酒精、NaClO、升汞、SDS等，且消毒劑濃度的選擇也有所不同＼[8，11＼]。潘羨心等＼[12＼]分離香蕉內(nèi)生細菌時，香蕉葉片和葉鞘采用了兩步消毒法，香蕉根則采用了三步消毒法，選用的消毒劑為乙醇和次氯酸鈉，并且所用乙醇和次氯酸鈉濃度分別為70%和3.25%，共獲得30株內(nèi)生細菌。

3.2 分泌IAA內(nèi)生細菌的篩選

實驗中篩選到具有IAA分泌能力的內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA能力均較弱，IAA分泌量都小于20 mg/L。篩選出的內(nèi)生細菌對供試牧草種子的發(fā)芽均有一定促生作用，說明在菌株分泌低濃度IAA條件下，對植物種子的發(fā)芽有促生作用，但差異不顯著。實驗中未發(fā)現(xiàn)促生作用具有專一性，即對供試的豆科植物種子及禾本科植物種子的發(fā)芽均有一定促進作用。劉琳等＼[13＼]從春蘭根組織中共分離出256株內(nèi)生細菌，其中，57株具有分泌IAA的能力，且產(chǎn)量高于50 μg/ mL的內(nèi)生細菌為9株（15.8%），產(chǎn)量介于20～50 μg/mL的內(nèi)生細菌為14株（24.6%），其余34株（59.7%）產(chǎn)量低于20 μg/mL。吳瑛等＼[14＼]研究燕麥根際固氮菌分泌IAA的動態(tài)變化時，篩選出4株具有IAA分泌能力的菌株，且測定其分泌IAA能力分別為29.1、25.2、25.5、36.1 μg/mL。此次實驗中篩選出的分泌IAA的內(nèi)生細菌與其相比，分泌量較少。

參考文獻：

＼[1＼] Hurek T，Handley L L，ReinholdHurek B，et al.Azoarcus grass endophytes contribute fixed nitrogen to the plant in an unculturable state＼[J＼].Mol PlantMicrobe Interact，2002，15：233-242.

＼[2＼] Iniguez A L，Dong Y，Triplett E W.Nitrogen fixation in wheat provided by Klebsiella pneumoniae 342＼[J＼].Mol PlantMicrobe Interact，2004，17：1078-1085.

＼[3＼] Sevilla M，Burris R H，Gunapala N，et al.Comparison of benefit to sugarcane plant growth and 15N2 incorporation following inoculation of sterile plants with Acetobacter diazotrophicus wildtype and Nif mutants strains＼[J＼].Mol PlantMicrobe Interact，2001，14：358-366.

＼[4＼] Sturz A V，Christie B R，Nowak J.Bacterial endophytes：Potential role in developing sustainable systems of crop production＼[J＼].Crit Rev Plant Sci，2000，19：1-30.

＼[5＼] 王辰月，陳秀蓉，楊成德，等.線葉嵩草內(nèi)生細菌的鑒定及溶磷效果的初步研究＼[J＼].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46（3）：99-103.

＼[6＼] Siciliano S D，Germida J J.Taxonomic diversity of bacteria associated with the roots of fieldgrown transgenic Brassica napus cv.Quest，compared to the nontransgenic B napus cv.Excel and B napus cv.Parkland＼[ J＼].FEMS Microbiology Ecology，1999，29（3）：263-272.

＼[7＼] 何紅，邱思鑫，胡方平，等.植物內(nèi)生細菌生物學(xué)作用研究進展＼[J＼].微生物學(xué)雜志，2004，24（3）：40-45.

＼[8＼] 滿百膺.東祁連山高寒牧草內(nèi)生細菌分離、鑒定及其生物學(xué)功能研究＼[D＼].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

＼[9＼] Glickmann E，Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria＼[J＼].Applied and Environmental Microbiology，1995，619（2）：793-796.

＼[10＼] 韓建國.牧草種子學(xué)＼[M＼].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007：111.

＼[11＼] Pleban S，Ingel F，Chet I.Control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in the greenhouse using endophytic Bacillus spp＼[J＼].European Journal of Plant Pathology，1995，101：665-672.

＼[12＼] 潘羨心，彭建華，劉先寶，等.一株產(chǎn)鐵載體香蕉拮抗內(nèi)生細菌的分離及鑒定＼[J＼].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2009，33（4）：4-8.

＼[13＼] 劉琳，孫磊，張瑞英，等.春蘭根中可分泌吲哚乙酸的內(nèi)生細菌多樣性＼[J＼].生物多樣性，2010，18（2）：195-200.

＼[14＼] 吳瑛，席琳喬.燕麥根際固氮菌分泌IAA的動態(tài)變化研究＼[J＼].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（15）：4424-4425，4441.