丹參多酚酸鹽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子表達的影響

王曉娟

丹參多酚酸鹽(salvianolate)為丹參的水提物，其主要成分為丹參乙酸鎂(magnesium lithospermate B)。文獻報道［1-2］丹參多酚酸鹽對缺血性疾病有明顯的療效，對人血管內(nèi)皮細胞有促遷移及增殖的作用。骨折的愈合一直是學者們長期研究的難題［3］。骨折愈合過程中，骨折端新生血管的長入是其重要的步驟之一［4-5］，干細胞的歸巢是骨折修復(fù)的重要來源［6-7］。如果提高干細胞的促新生血管形成能力，將大大提高骨折的愈合能力。本研究采用細胞共培養(yǎng)的方法，觀察丹參多酚酸鹽對骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及與血管形成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達情況，初步探討中藥對促骨折愈合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國);DMEM 培養(yǎng)基(賽業(yè)生物科技有限公司，廣州，中國);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物公司);丹參多酚酸鹽(上海綠谷生醫(yī)藥有限公司，國藥準字Z20050246);VEGF 及GAPDH 引物均購自上海生物工程有限公司;TRIzol(Invitogen 公司，加利福尼亞，美國)，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(TOYOBO Life Science，東京，日本);SYBR?Green Real time PCR master Mix-Plus(TOYOBO Life Science，東京，日本)。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(型號DH-801 上海三騰儀器有限公司，上海，中國);酶聯(lián)免疫檢測儀(型號RJ17DG5033A 中西集團，遼寧沈陽，中國);紫外分光光度計(Beckman DU530 Germany);StepOneTMReal-Time PCR System(Applied Biosystems Company，Carlsbad，USA)。

1.3 分組

實驗組為丹參多酚酸鹽與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cell，BMSC)共培養(yǎng);對照組為大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞單獨培養(yǎng)。

1.4 觀察指標與實驗步驟

1.4.1 鏡下觀察細胞生長情況 實驗組為丹參多酚酸鹽(0.5 mg/ml)與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(P2代)5×104在六孔板中共培養(yǎng)，將大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞5×104在六孔板中培養(yǎng)做為對照組。用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37℃飽和濕度及5%二氧化碳孵育箱中分別進行共培養(yǎng)和單獨培養(yǎng)48 小時后觀察細胞生長情況。

1.4.2 MTT 檢測 用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔5 000 個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μl。培養(yǎng)細胞同一般培養(yǎng)條件，分別于第1、3、5、7 天，每組分別取5 個孔，每孔加MTT 溶液(5 mg/ml 用PBS 配)20 μl。繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μl DMSO，振蕩10 分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4.3 細胞VEGF mRNA 檢測 將培養(yǎng)7 天后的細胞用胰酶消化后收集。于勻漿器中加入1 ml Trizol，充分研磨后靜置15 分鐘，經(jīng)氯仿萃取、異丙醇沉淀、乙醇洗滌后加入30 μl DEPC 水溶解提取總RNA，用分光光度儀檢測RNA 純度及濃度。反轉(zhuǎn)錄及擴增均選用東洋紡試劑盒，按其說明書步驟進行。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 秒，三步法:95℃15秒，58℃15 秒，72℃45 秒40 個循環(huán)。VEGF 引物:上游引物5’-GCGGGCTGCCTCGCAGTC-3’，下游引物5’-TCACCGCCTTGGCTTGTCAC-3’，GAPDH 上游引物5’-GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3’，下游引物5’-GGTTCACACCCATCACAAACATG-3’，以GAPDH為內(nèi)參照，根據(jù)熒光定量PCR 儀顯示的CT 值結(jié)果，以對照組做參照通過2-ΔΔCt方法計算RQ 值分析兩組相對基因表達差異。

圖1 顯微鏡下觀察兩組細胞生長情況(×100)

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞顯微鏡下觀察結(jié)果

兩組細胞在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 小時后，在倒置顯微鏡下觀察，兩組培養(yǎng)細胞均未發(fā)現(xiàn)污染及支原體感染跡象，100 倍顯微視野下見實驗組細胞密集程度明顯高于對照組，見圖1。

2.2 MTT 測定結(jié)果

兩組細胞在體外培養(yǎng)對數(shù)生長期第1、3、5、7 天均呈明顯上升趨勢，細胞生長第一天兩組無統(tǒng)計學差異，實驗組于第三天后均高于對照組。P ＜0.05，有統(tǒng)計學差異。說明丹參多酚酸鹽對BMSC 有促增殖作用，見圖2。

2.3 qRT-PCR 測定結(jié)果

提取RNA，稀釋100 位后用分光光度儀檢測A260 及A280 的OD 值，求得A260/A280 比值在1.8 ～2.0 之間，說明RNA 純度較高。據(jù)A260 的OD 值計算得RNA 濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及擴增后行熒光定量，獲得CT 值，計算RQ 值，結(jié)果見圖3。丹參多酚酸鹽與BMSC 共培養(yǎng)組(Exp)的VEGF mRNA 表達量明顯高于BMSC 單獨培養(yǎng)組(Con)。

3 討論

丹參為唇形科鼠尾草屬植物干燥的根及根莖，有“一味丹參，功同四物”之美譽。作為經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥材，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰和養(yǎng)血安神的功效［8］。臨床上多用于治療缺血性疾病，研究證實其治療機制與促血管生成相關(guān)［9］。丹參多酚酸鹽為丹參的水溶性提取物，具有有效成分明確、質(zhì)量易控以及療效穩(wěn)定等優(yōu)點。較中醫(yī)藥的復(fù)方合劑有效成份更純更有效，并減少了期副作用［10］。中醫(yī)認為，骨折的愈合過程是一個“瘀去、新生、骨合”的過程。根據(jù)骨折的證候特點，可分為消淤退腫期、活血生新期及固本培元期。而在骨折發(fā)生后1 ～2 周內(nèi)，由于肢體內(nèi)部筋骨脈絡(luò)均受損傷，離經(jīng)之血淤積不散、氣血之道不得暢通，故疼痛劇烈，患部淤血腫脹，治宜活血化淤，消腫止痛。

作為一種復(fù)合材料，骨組織生長的形成是一個復(fù)雜的過程，包括分子、細胞、生化代謝的變化［11］。骨折的直接反應(yīng)是血腫的形成和炎癥反應(yīng)，血腫形成，阻止更多的流血和損耗因子。炎癥反應(yīng)提供兩骨端初始穩(wěn)定，啟動多個愈合過程中的信號轉(zhuǎn)導通路。前體細胞侵入骨折端之間并形成新的血管，成纖維細胞，和其他支持細胞肉芽組織形成。MSCs遷移至骨折端后分化為前體細胞，釋放的細胞因子具特異性抗炎作用并促新生血管生成［12］。骨髓間充質(zhì)干細胞的招募及遷移至骨折部位可有效促進骨折的修復(fù)已達成共識［13］。如果能促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及提高其血管生成的能力必將提高骨折的修復(fù)能力。VEGF 作為目前研究較清楚，作用最明確的促血管生長因子，其作用是血管內(nèi)皮細胞特異的有絲分裂原，合成后以旁分泌形成發(fā)揮生物效應(yīng)［2］。目前所報道的與血管生成有關(guān)的因子許多均與VEGF 的表達相關(guān)。提高VEGF 的表達則說明進一步促新生血管形成。本實驗對基因表達的研究采用實時熒光定量PCR 技術(shù)的定量分析，其定量分析的準確度和靈敏度均遠高于以前的方法。本實驗證實丹參多酚酸鹽促進了骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，并可上調(diào)其表達VEGF mRNA 水平，進而促進血管生成。丹參多酚酸鹽在促血管生成的同時還對腦、肝、腎、肺等組織有保護作用，符合中醫(yī)對骨折的全身施治的辨證治療原則，具有良好的發(fā)展前景。關(guān)于其對骨折早期促進愈合作用的體內(nèi)實驗還有待于進一步研究。

［1］ 汪志忠，黎紅華，吳非，等．丹參多酚對急性腦梗死患者血清單核細胞趨化蛋白-1 及白細胞介素-10 的影響［J］．神經(jīng)損傷與功能重建，2013，8(1):71-72．

［2］ 徐杰，范維琥．丹參多酚酸鹽對人血管內(nèi)皮細胞遷移的影響［J］．中西醫(yī)結(jié)合學報，2013，1(3):211-214．

［3］ Li，H．，L．H． Le，M．D． Sacchi，et al．Ultrasound imaging of long bone fractures and healing with the split-step fourier imaging method［J］．Ultrasound in Medicine and Biology，2013，39(8):1482-1490．

［4］ Cheung，W．H．，M．H． Sun，Y．P． Zheng，et al． Stimulated angiogenesis for fracture healing augmented by low-magnitude，high-frequency vibration in a rat model-evaluation of pulsed-wave doppler，3-D power Doppler ultrasonography and micro-CT microangiography［J］．Ultrasound in Medicine and Biology，2012，38(12):2120-2129．

［5］ Geris，L．，A． Gerisch，J．V． Sloten，et al． Angiogenesis in bone fracture healing:a bioregulatory model［J］．Journal of Theoretical Biology，2008，251(1):137-158．

［6］ Toupadakis，C．A．，J．L．Granick，M．Sagy，et al．Mobilization of endogenous stem cell populations enhances fracture healing in a murine femoral fracture model［J］．Cytotherapy，2013，15(9):1136-1147．

［7］ Weaver，A．S．，Y．P．Su，D．L．Begun，et al．The effects of axial displacement on fracture callus morphology and MSC homing depend on the timing of application［J］．Bone，2010，47(1):41-48．

［8］ 張曉雷，陳俊華，郭春霞，等． 丹參多酚酸鹽的藥理作用研究［J］．世界臨床藥物，2013，34(5):292-297．

［9］ 池曉霞，高心宇．丹參調(diào)節(jié)血管新生及其機制研究進展［J］．海峽藥學，2010，22(2):3-6．

［10］ 宋芳嬌，曾克武，王學美．中藥復(fù)方有效成分組相關(guān)研究方法的研究進展［J］．環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5(12):951-955．

［11］ Obermeyer，T．，D． Yonick，K． Lauing，et al． Mesenchymal Stem Cells Facilitate Fracture Repair in an Alcohol-Induced Impaired Healing Model［J］．Journal of Orthopaedic Trauma，2012，26(12):712-718

［12］ Rubin，C．，A．S．Turner，S．Bain，et al．Anabolism． Low mechanical signals strengthen long bones［J］． Nature，2001，412(6847):603-604．

［13］ Granero-Molto，F(xiàn)．，J．A．Weis，M．I．Miga，et al．Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing［J］．Stem Cells，2009，27(8):1887-1898．