深低溫冷凍-酶洗法制備兔組織工程氣管支架的研究

李建忠，吳 凡，汪 健，金 巖，韓 勇，閆小龍，倪云峰，趙晉波，張志培，李小飛

各種原因如創(chuàng)傷、腫瘤等引起的長段氣管(≥60mm)缺損，因吻合口張力過大不能直接縫合時［1］，需要用人工氣管來修復(fù)，其中同種異體組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來源等方面的優(yōu)勢逐漸成為氣管重建外科的研究熱點。同種異體組織工程化氣管支架制備較為常用的去抗原方法有深低溫冷凍法［2－3］和酶消化法［4－5］，但二者都有自身的缺陷。氣管的免疫原性主要來自于黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞核，而深低溫冷凍法不能有效地去除氣管黏膜上皮細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)有利于組織工程氣管的再細(xì)胞化，酶消化法能夠有效去除氣管黏膜上皮細(xì)胞，同時去除了細(xì)胞外基質(zhì)，不利于再細(xì)胞化。本實驗探討深低溫冷凍-酶洗法處理后的氣管支架在生物力學(xué)、去除黏膜上皮細(xì)胞及氣管細(xì)胞基質(zhì)保持方面，與深低溫冷凍法和酶消化法有無差別。

材料與方法

1 實驗材料

健康新西蘭白兔購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，脫氧膽酸鈉購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，脫氧核糖核酸酶-Ⅰ(DNase-Ⅰ)購自德國Roche公司，兩性霉素B購自美國Amresco公司。蔡司正置顯微鏡Axioskop 40購自德國ZEISS公司，鎢燈絲掃描電鏡VEGA3 LMH購自捷克Tescan公司，電子實驗機購自日本Shimadzu公司。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 健康新西蘭兔24只，雌雄不限，體重2.5～3.0kg。將其隨機等分為4組，每組6只。A組是對照組，行新鮮氣管檢測;B、C、D是實驗組，分別進(jìn)行深低溫冷凍法、酶洗法、深低溫冷凍－酶洗法處理。

2.2 氣管支架的制備 深低溫冷凍法［2－3］制備B組氣管支架:耳緣靜脈空氣栓塞致死，無菌條件下取出氣管，迅速剝離氣管上的疏松結(jié)締組織。經(jīng)生理鹽水沖洗，并在20萬U/L青霉素、200mg/L慶大霉素溶液中浸泡3min后，將氣管放入無菌生物袋中，然后將氣管浸泡于冷凍保護(hù)液中，置于4℃冰箱冷平衡20min，再于程序降溫儀的冷凍箱中程序降溫，降溫速率－1℃/min，至－80℃后投入－196℃液氮冷凍6～8周。檢測前將冷凍袋從液氮中取出，置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)，輕輕搖動，使氣管段均勻快速解凍復(fù)溫。

酶洗法［4－5］制備C組氣管支架:無菌條件下迅速剝離氣管的疏松結(jié)締組織，然后將氣管在含有1%青霉素、1%兩性霉素B的磷酸緩沖液(PBS)中沖洗3min，置入4℃純凈水中浸泡48h后，將氣管在含有4%去氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3h，然后在含有DNase-I 2 000KU/L的生理鹽水中浸泡3h，如此循環(huán)3個周期，然后浸泡在4℃的PBS溶液中準(zhǔn)備檢測。

深低溫冷凍-酶洗法制備D組氣管支架:氣管支架前期處理同B組氣管支架，至－80℃后投入－196℃液氮冷凍6周。冷凍后將氣管在含有4%去氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3h，再在含有DNase-I 2 000KU/L的生理鹽水中浸泡3h，然后浸泡在4℃的PBS溶液中準(zhǔn)備檢測。

3 生物學(xué)檢測

用直尺測量A、B、C、D組氣管的長度;參照Macchiarini等生物力學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)［5］，將A、B、C、D組制備好的氣管支架固定在電子實驗機上，測出最大拉伸力、破裂力、破裂點，并算出變異率。將處理后的氣管在甲醛中浸泡24h，行脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片處理后，HE染色，光鏡觀察。戊二醛固定A、B、C、D組氣管支架，梯度脫水，然后用CO2超臨界萃取，噴鉑金5min，掃面電鏡觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)形態(tài)

A組氣管黏膜上皮組織有大量完整的黏膜上皮細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞密集均勻分布于氣管軟骨，見圖1a;B組氣管黏膜上皮組織仍有完整黏膜上皮細(xì)胞，見圖1b;C組氣管黏膜上皮組織未見完整的黏膜上皮細(xì)胞，見圖1c;D組氣管黏膜上皮組織未見完整的黏膜上皮細(xì)胞，可見一些殘存的細(xì)胞基質(zhì)，見圖1d。

圖1 組織學(xué)觀察:a.對照組未處理氣管(HE×400);b.深低溫冷凍法氣管(HE×400);c.酶洗法處理期氣管(HE×400);d.改良的深低溫冷凍法氣管(HE×400)

2 掃描電鏡觀察

A、B、D組氣管黏膜上皮組織見豐富細(xì)胞外基質(zhì)，未見膠原纖維，見圖2a、b、d;C組氣管黏膜上皮組織見膠原纖維，未見細(xì)胞外基質(zhì)，見圖2c。

圖2 掃描電鏡觀察處理:a.對照組未處理氣管(×3000);b.深低溫冷凍法氣管(×3000);c.酶洗法處理期氣管(×3000);d.改良的深低溫冷凍法氣管(×3000)

3 生物力學(xué)檢測

如表1示:各組氣管長度均數(shù)基本相等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。組間兩兩比較顯示，最大拉伸力、破裂力、變異率無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 氣管支架生物力學(xué)比較(±s)

表1 氣管支架生物力學(xué)比較(±s)

組別 氣管長度 最大拉伸力(N) 破裂力(N) 破裂點(cm) 變異率(%)A 5.02±0.60 4.465±0.65 0.645±0.072 9.64±0.48202±8 B 4.98±0.57 4.425±0.55 0.535±0.082 9.48±0.50 198±10 C 4.96±0.58 4.375±0.45 0.525±0.064 9.58±0.52 197±9 D 5.10±0.61 4.405±0.30 0.540±0.042 9.86±0.46 200±12

討 論

氣管支架是構(gòu)建組織工程氣管的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。理想的氣管支架應(yīng)滿足以下條件:易彎曲成形，且不致塌陷;允許呼吸道上皮細(xì)胞沿管腔生長;引起的炎性反應(yīng)最小，無致癌性［6－7］。同種異體氣管支架被公認(rèn)為組織工程氣管理想的氣管來源，但是其免疫排斥影響組織工程再細(xì)胞化和再血管化，必須通過適當(dāng)?shù)奶幚砣コ庖咴?，保持力學(xué)性能，保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)。同種異體移植物引起的免疫反應(yīng)，多由移植物細(xì)胞膜表面的抗原蛋白和細(xì)胞核所致，而宿主對特異性無細(xì)胞基質(zhì)的炎癥-免疫反應(yīng)并不明顯。氣管黏膜上皮細(xì)胞是引起氣管同種異體移植免疫排斥反應(yīng)的主要細(xì)胞，而成軟骨細(xì)胞基本無免疫原性，深低溫冷凍法不能有效去除氣管黏膜上皮細(xì)胞。Macchiarini等［5］運用酶洗法制備氣管支架完成了世界首例同種異體組織工程氣管移植，為氣管重建指明了方向。然而，患者移植后9個月發(fā)生氣管塌陷，這可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不能很好的再細(xì)胞化有關(guān)。本研究探討深低溫冷凍-酶洗法(將酶洗法和深低溫冷凍法相結(jié)合)制備組織工程氣管支架。

本實驗將兔氣管分別進(jìn)行深低溫冷凍法、酶洗法及深低溫冷凍-酶洗法處理，組織學(xué)結(jié)果顯示運用深低溫冷凍-酶洗法制備的氣管支架沒有完整的黏膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞核破碎。由此推斷深低溫冷凍-酶洗法能夠去除氣管支架免疫原性。同時還證實，深低溫冷凍-酶洗法比酶洗法制備的氣管支架有更多的細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)沒有免疫原性，有助于再細(xì)胞化和再血管化，因此運用深低溫冷凍-酶洗法比酶洗法獲得的氣管支架更有助于受體的氣管黏膜上皮細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞存活，微血管生成，防止氣管塌陷。在生物力學(xué)方面，深低溫冷凍-酶洗法制備的氣管支架與其他組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，深低溫冷凍-酶洗法制備的氣管支架可能更適合制備組織工程氣管，其實際效果有待于動物實驗的進(jìn)一步研究。

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