浙江漢族長(zhǎng)壽人群血脂水平及ApoB基因Xba I-RFLR和3’-VNTR多態(tài)性的相關(guān)性研究*

盛愛(ài)萍，　周　標(biāo)，　施　達(dá)，　沈　毅

(1金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 浙江 金華 321017;2浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江 杭州 310051;3金華市疾病預(yù)防控制中心，浙江 金華 321002; 4浙江大學(xué)，浙江 杭州 310058)

根據(jù)2007年8月公布的《中國(guó)成人血脂異常防治指南》[1]指出,血清總膽固醇(total cholesterol,TC)或低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)升高是冠心病和缺血性腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。而載脂蛋白B (apolipoprotein B,ApoB)參與體內(nèi)的脂質(zhì)代謝，是LDL-C的主要蛋白質(zhì)成分。本文研究浙江漢族長(zhǎng)壽人群的血脂水平及ApoB基因XbaI-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和3’-可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandam repeat,VNTR)多態(tài)性對(duì)血脂四項(xiàng)和載脂蛋白水平是否有影響，希望能進(jìn)一步了解長(zhǎng)壽發(fā)生的機(jī)制。

材　料　和　方　法

1研究對(duì)象

研究對(duì)象均為漢族，采用以人群為基礎(chǔ)的多組病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)，病例共有2組，一組為長(zhǎng)壽老人組(≥90歲)96人；另一組為長(zhǎng)壽老人組的子女104人。共設(shè)立2組對(duì)照，一組選同長(zhǎng)壽老人組子女的年齡、職業(yè)、性別、經(jīng)濟(jì)收入和居住地相匹配的人群104人為對(duì)照，另一組選同長(zhǎng)壽老人組子女的年齡、性別相匹配的非長(zhǎng)壽老人組(壽命小于70歲)的子女95人為對(duì)照。完成長(zhǎng)壽老人組體格檢查和血樣采集共80份，有效率為83.3%(80/96)。在長(zhǎng)壽老人組家庭中，選擇長(zhǎng)壽老人組的子女104人，完成體格檢查和血樣采集共90份，有效率為86.5%(90/104)。完成正常對(duì)照組體格檢查和血樣采集共89份，有效率為85.6%(89/104)。完成非長(zhǎng)壽老人組的子女體格檢查和血樣采集共87份，有效率為90.6%(87/95)。最終完成共計(jì)346份。

2方法

2.1一般指標(biāo)、ApoB與血脂四項(xiàng)測(cè)定由當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院結(jié)合農(nóng)村健康體檢對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行身高、體重、血壓、血糖等項(xiàng)目檢查和血樣采集，研究對(duì)象于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈采集2.5 mL全血，靜置后分離血清，送當(dāng)?shù)蒯t(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)ApoB和血脂四項(xiàng):TC、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和LDL-C。ApoB檢測(cè)采用ApoB檢測(cè)試劑盒，注冊(cè)證書(shū)編號(hào)為浙食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2006第2400247號(hào)，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)YZB/浙1332-2006。血脂四項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)采用日立BM717全自動(dòng)生化分析儀，德國(guó)Centronic試劑。儀器用廠家配套的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)，各項(xiàng)目均采用有效的質(zhì)量控制措施，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

2.2基因多態(tài)性分析基因組DNA抽提采用改良鹽析法。應(yīng)用 PCR方法擴(kuò)增ApoB基因第26外顯子，上、下游引物分別為：5′-ACC GGC CCT GGC GCC CGC CAG CA-3’和5′-AGC AGC AAG AGT CCA CCA ATC-3’。采用PxE Thermal Cycler 5.0擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增， PCR擴(kuò)增后，用10 U限制性內(nèi)切酶XbaI于37 ℃水浴消化4 h。在瓊脂糖凝膠中電泳后觀察紫外燈下帶型。出現(xiàn)1條長(zhǎng)度為359 bp的條帶，為X-X-純合子；出現(xiàn)359 bp、229 bp和130 bp 3條帶，為X+X-雜合子；出現(xiàn)229 bp和130 bp 2條帶，為X+X+純合子,見(jiàn)圖1。

Figure 1. The result ofApoBgeneXbaI RFLP genotyping.M:marker；0,3,4: X-X-；2,5:X+X+；1,6:X+X-.

圖1ApoB基因XbaIRFLP分型結(jié)果

應(yīng)用 PCR方法擴(kuò)增ApoB基因3’端 VNTR重復(fù)序列，上、下游引物分別為：5′-AAC GGA GAA ATT ATG GAG GG-3’和 5′-GCA CAT GAA GAC ACC AGA GG-3’。將PCR產(chǎn)物冷卻，置4 ℃保存。分型采用 PCR擴(kuò)增的 DNA片段電泳法。以已知長(zhǎng)度的DNA片段為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)等位基因進(jìn)行分級(jí)。以核心序列的重復(fù)次數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)等位基因進(jìn)行命名。串聯(lián)重復(fù)序列的拷貝數(shù)=(片段長(zhǎng)度-151 bp)/15 bp。不同的等位基因可組合成不同的基因型，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The result ofApoBgene 3’-VNTR genotyping. M:marker;fragment length of 22 is 480 bp，copy numberof repeat sequences=(480-151) bp/15 bp；fragment length of 24 is 510 bp，copy number of repeat sequences =(510-151) bp/15 bp；and so on.

圖2ApoB基因3’-VNTR分型結(jié)果

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用EpiData 3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；偏態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示,組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用2檢驗(yàn)。進(jìn)一步采用多元線性回歸分析長(zhǎng)壽與對(duì)照組在各體格檢查指標(biāo)上的差異。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1人口學(xué)特征

長(zhǎng)壽老人、長(zhǎng)壽子女、正常對(duì)照和非長(zhǎng)壽子女4組在性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;長(zhǎng)壽子女組、正常對(duì)照組與非長(zhǎng)壽子女組在年齡、文化程度和獨(dú)居生活上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1。

表1　長(zhǎng)壽及對(duì)照組的人口學(xué)特征

Age,education and living alone in the children of longevous elders，normal control group and the children of non-longevous elders were not significant different (P>0.05)

2體格檢查結(jié)果比較

除了肝功能以外，4組人群在下述各體檢指標(biāo)上均存在顯著差異。各組的兩兩比較采用SNK法，身高為長(zhǎng)壽老人<長(zhǎng)壽子女=正常對(duì)照=非長(zhǎng)壽子女；體重和體重指數(shù)(body mass index,BMI)均為長(zhǎng)壽老人<長(zhǎng)壽子女=正常對(duì)照<非長(zhǎng)壽子女；收縮壓為長(zhǎng)壽老人=非長(zhǎng)壽子女=正常對(duì)照<長(zhǎng)壽子女；舒張壓為長(zhǎng)壽老人=長(zhǎng)壽子女<正常對(duì)照=非長(zhǎng)壽子女；血糖為長(zhǎng)壽老人=正常對(duì)照=非長(zhǎng)壽子女>長(zhǎng)壽子女；TC為長(zhǎng)壽老人=非長(zhǎng)壽子女>正常對(duì)照>長(zhǎng)壽子女；TG為長(zhǎng)壽子女<長(zhǎng)壽老人=正常對(duì)照<非長(zhǎng)壽子女；HDL-C為長(zhǎng)壽老人=長(zhǎng)壽子女>正常對(duì)照>非長(zhǎng)壽子女；LDL-C為長(zhǎng)壽老人=長(zhǎng)壽子女<正常對(duì)照=非長(zhǎng)壽子女；ApoB為長(zhǎng)壽老人=長(zhǎng)壽子女<正常對(duì)照<非長(zhǎng)壽子女,見(jiàn)表2。

表2　長(zhǎng)壽及對(duì)照組體檢特征

The data of ALT and TG were expressed as median (interquartile range) and compared using Kruskal-Wallis test.

3長(zhǎng)壽及對(duì)照組體檢特征的多元線性回歸

考慮到4組在社會(huì)人口學(xué)特征上還存在著分布上的差異，在多元線性回歸中，以正常對(duì)照組為參照，控制了年齡、性別、民族、獨(dú)居及教育等社會(huì)人口學(xué)因素的影響，進(jìn)一步了解長(zhǎng)壽與對(duì)照在體檢特征上的差異。

以正常對(duì)照組為參照，非長(zhǎng)壽子女組在BMI上的回歸系數(shù)β=0.978(P<0.05)，也就是說(shuō)，BMI與非長(zhǎng)壽呈正相關(guān)，表明BMI增大不利于長(zhǎng)壽；長(zhǎng)壽老人及長(zhǎng)壽子女組收縮壓、舒張壓和血糖的回歸系數(shù)均為負(fù)值，其中長(zhǎng)壽子女組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也就是說(shuō)，收縮壓、舒張壓和血糖與長(zhǎng)壽呈負(fù)相關(guān)，表明高血壓及高血糖不利于長(zhǎng)壽；長(zhǎng)壽子女組TC、TG、LDL-C及ApoB的回歸系數(shù)均為負(fù)值，且除TC外，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也就是說(shuō)，上述指標(biāo)與長(zhǎng)壽呈負(fù)相關(guān)，表明這些指標(biāo)的升高不利于長(zhǎng)壽。非長(zhǎng)壽子女TC、TG、LDL-C及ApoB的回歸系數(shù)均為正值，且除LDL-C外，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明上述指標(biāo)與非長(zhǎng)壽呈正相關(guān)，同樣說(shuō)明這些指標(biāo)的升高不利于長(zhǎng)壽；長(zhǎng)壽子女組HDL-C的回歸系數(shù)均為正值，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，也就是說(shuō)，HDL-C與長(zhǎng)壽呈正相關(guān)，表明HDL-C升高有利于長(zhǎng)壽,見(jiàn)表3。

4長(zhǎng)壽及對(duì)照組ApoB基因多態(tài)性特征

ApoB的XbaI-RFLP有3種基因型：X-X-、X+X-及X+X+。4組中以X-X-基因型為主，分別占86.2%、86.7%、87.6%和86.2%，其次是X+X-基因型，分別占12.5%、13.3%、12.4%和13.8%。X+X+基因型只在長(zhǎng)壽老人中發(fā)現(xiàn)1例。4組在3種基因型的分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。等位基因4組均以X-等位基因?yàn)橹鳎謩e占92.5%、93.3%、93.8%和93.1%。4組在等位基因的分布上也沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

ApoB基因3’-VNTR多態(tài)性基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，等位基因共有15種, 最大的等位基因是HVE 52，最小的等位基因是HVE 22。以HVE 38為界，可將等位基因分為小等位基因(HVE<38)和大等位基因(HVE≥38)。4組中小等位基因分別占96.2%、96.7%、85.4%和80.0%，長(zhǎng)壽人群及其子女小等位基因所占比例較高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)表4。

5不同基因型間血脂及ApoB水平比較

擁有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有X-X-基因型的人，且除TG外，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與此相反，擁有X+X-基因型的人，其HDL-C低于擁有X-X-基因型的人，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。擁有X+X-基因型的人ApoB含量顯著高于擁有X-X-基因型的人(P<0.01)。

表3長(zhǎng)壽及對(duì)照組體檢特征的多元線性回歸

Table 3. Multiple liner regression of physical characteristics in longevity and control groups

Variableβ(SE)StandardizedβPBMI　Longevouselders-1．200(1．140)-0．180>0．05　Childrenoflongevouselders0．330(0．407)0．051>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．978(0．474)0．151<0．05SBP　Longevvouselders-1．808(3．112)-0．039>0．05　Childrenoflongevouselders-6．980(3．255)-0．139<0．05　Childrenofnon?longevouselders0．495(3．783)0．010>0．05DBP　Longevouselders-7．397(4．568)-0．275>0．05　Childrenoflongevouselders-6．163(1．632)-0．239<0．01　Childrenofnon?longevouselders2．637(1．896)0．106>0．05ALT　Longevouselders0．091(0．124)0．129>0．05　Childrenoflongevouselders0．011(0．044)0．017>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．077(0．052)0．112>0．05GLU　Longevouselders-0．101(0．571)-0．030>0．05　Childrenoflongevouselders-0．607(0．204)-0．189<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．389(0．237)0．120>0．05TC　Longevouselders0．077(0．550)0．128>0．05　Childrenoflongevouselders-0．335(0．196)-0．106>0．05　Childrenofnon?longevouselders0．574(0．228)0．180<0．05TG　Longevouselders0．269(0．692)0．065>0．05　Childrenoflongevouselders-0．516(0．247)-0．131<0．05　Childrenofnon?longevouselders0．626(0．287)0．157<0．05HDL?C　Longevouselders0．022(0．056)0．050>0．05　Childrenoflongevouselders0．119(0．020)0．277<0．01　Childrenofnon?longevouselders-0．043(0．023)-0．098>0．05LDL?C　Longevouselders0．148(0．106)0．186>0．05　Childrenoflongevouselders-0．136(0．038)-0．179<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．071(0．044)0．092>0．05ApoB　Longevouselders0．006(0．075)0．009>0．05　Childrenoflongevouselders-0．132(0．027)-0．227<0．01　Childrenofnon?longevouselders0．101(0．031)0．172<0．01

表4　長(zhǎng)壽及對(duì)照組ApoB基因多態(tài)性特征

ApoB基因3’-VNTR大等位基因與小等位基因在血脂及ApoB的水平上也存在著差異。擁有大等位基因的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有小等位基因的人，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而HDL-C在擁有大等位基因的人體內(nèi)含量較低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。從ApoB的含量上看，擁有大等位基因的人含量顯著高于擁有小等位基因的人(P<0.01),見(jiàn)表5。

表5　不同基因型間血脂及ApoB水平比較

**P<0.01vsX-X-;##P<0.01vsVNTR<38.

討　　論

血脂是血漿中的中性脂肪和類(lèi)脂的總稱, 廣泛存在于人體中，它們是生命細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝必需物質(zhì)。本文研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)壽老人HDL-C含量高于其它3組，而LDL-C含量低于正常對(duì)照及非長(zhǎng)壽子女組，TC含量也比正常對(duì)照及非長(zhǎng)壽組要低，這與許多研究結(jié)果[2-3]一致，表明HDL-C升高有利于長(zhǎng)壽, TC、TG和LDL-C的升高不利于長(zhǎng)壽，進(jìn)一步證實(shí)了血脂與長(zhǎng)壽有著密切的關(guān)系，這可能是因?yàn)槌鼿DL-C以外的血脂水平升高會(huì)導(dǎo)致冠心病與腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增大，進(jìn)而成為長(zhǎng)壽的危險(xiǎn)因素。

多數(shù)研究[4]證實(shí)，ApoB基因XbaI位點(diǎn)是載脂蛋白和血脂表型的相關(guān)位點(diǎn)，其多態(tài)性與血清脂質(zhì)水平及ApoB水平密切相關(guān)，但不同基因型對(duì)不同血脂代謝的影響存在爭(zhēng)議。Boekholdt等[5]發(fā)現(xiàn)X+等位基因與較高水平的LDL-C及ApoB有關(guān)，而與冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。Puri等[6]的發(fā)現(xiàn)則與之有所不同，冠心病組中X-X-基因型頻率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且冠心病組中X-X-基因型與增高的血清ApoB及LDL-C相關(guān)，而與其它血脂異常無(wú)明顯相關(guān)，提示X-等位基因與冠心病發(fā)病有一定相關(guān)性。在Benn等[7]的研究中，X+基因型與增高的總膽固醇、LDL-C和ApoB有顯著相關(guān)性(P<0.01)。姜文錫等[8]報(bào)道ApoB基因型X+X+與自然長(zhǎng)壽呈顯著正相關(guān)。本文的研究結(jié)果顯示ApoB基因XbaI-RFLP與長(zhǎng)壽之間并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的關(guān)聯(lián)，擁有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于擁有X-X-基因型的人，擁有X+X-基因型的人，其HDL-C低于擁有X-X-基因型的人，表明擁有X-X-基因型的人血脂水平較健康。

ApoB基因3’-VNTR對(duì)血脂、脂蛋白和載脂蛋白水平是否有影響，目前國(guó)內(nèi)外觀點(diǎn)尚不一致。有學(xué)者認(rèn)為冠心病人群中ApoB基因3’-VNTR與任何血脂變量都沒(méi)有關(guān)系[6]。姜文錫等[9]在維吾爾族人群的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)壽組中HVE 36和HVE 42頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，并且HVE 44、HVE 46、HVE 48和HVE 58僅見(jiàn)于長(zhǎng)壽組，而HVE 26、HVE 30和HVE 34顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。Garasto等[10]和Jemaa等[11]認(rèn)為帶有3’-VNTR大等位基因較帶有小等位基因的個(gè)體更易患血脂代謝異常性疾病。國(guó)內(nèi)孟康等[12]對(duì)老年高脂血癥患者的研究表明，患者中3’-VNTR大等位基因頻數(shù)明顯多于對(duì)照組，且TC、LDL-C和HDL-C水平與ApoB基因型增大相關(guān)，表明ApoB基因3’-VNTR多態(tài)性可能是影響血脂水平的遺傳因素之一。我們認(rèn)為，ApoB基因3’-VNTR與血脂水平有密切關(guān)系，擁有小等位基因的人的TC、TG、LDL-C及ApoB各指標(biāo)都較低，同時(shí)顯示長(zhǎng)壽人群及其子女小等位基因所占比例較高(P<0.01)，其可能的機(jī)理是：ApoB基因 3’-VNTR十分接近PolyA信號(hào)，有可能通過(guò)影響PolyA腺苷化，進(jìn)而干擾mRNA的穩(wěn)定性，從而影響其表達(dá)。也可能是3’-VNTR大等位基因與ApoB基因某一功能性核苷酸序列改變有連鎖不平衡，直接影響脂質(zhì)代謝從而增加心腦血管疾病的易感性。

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