采后殼聚糖處理對果實(shí)-病原菌互作中形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

張 璐，曾凱芳,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.西南大學(xué) 國家食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，重慶 400716)

目前，大量合成殺菌劑被用于控制果實(shí)采后病害，由于公眾和學(xué)者越來越重視合成化學(xué)物質(zhì)在食物鏈的積累問題，我們急需找到一些方法替代化學(xué)殺菌劑。殼聚糖(chitosan)學(xué)名為β-(1,4)聚-2-氨基-D-葡萄糖，來源于真菌細(xì)胞壁及介蟲(蟹、蝦)外殼，是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有安全、無毒、抑菌、可食及生物降解等多種特性。殼聚糖具有延緩果實(shí)成熟衰老、直接抑菌、作為激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)抗性的功能，目前殼聚糖在控制采后病害中具有很大潛力，它對許多園藝產(chǎn)品采后病害控制都有效果，如蘋果、覆盆子、梨、番茄、獼猴桃、草莓、甘椒、黃瓜、桃、荔枝等[1-5]，目前已用于延長果蔬貨架期。殼聚糖的抑菌功能與其質(zhì)量濃度、分子質(zhì)量、脫乙酰度及果實(shí)的種類密切相關(guān)，如1%或2%殼聚糖對控制采后青霉菌(Penicillium expansum)侵染蘋果有效果[5]，質(zhì)量濃度1g/100mL、分子質(zhì)量小于5×104u的殼聚糖對控制采后甜櫻桃腐敗效果更好[6]。通過基團(tuán)的化學(xué)修飾而制備的殼聚糖衍生物具有比殼聚糖更好的溶解性或抑菌性[7-9]。

用殼聚糖處理采后果蔬，殼聚糖、受病害感染的果實(shí)及病原菌在相互作用、相互識別的過程中，形成了一種錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。第一，病原菌侵染果實(shí)，從而獲取營養(yǎng)，對果實(shí)的結(jié)構(gòu)和生理代謝產(chǎn)生影響；第二，病原菌的侵染激發(fā)了果實(shí)自身的抗病能力，可以在一定程度上抵抗外界各種脅迫對果實(shí)造成的不良影響；第三，殼聚糖不但能直接作用于病原菌，影響它的侵染能力，也能作為一種天然信號分子，引起果蔬組織內(nèi)一系列抗性相關(guān)防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生。目前對殼聚糖控制果實(shí)病害的研究多從其防治效果、對病原菌的抑菌機(jī)理、提高果實(shí)抗病性等方面單獨(dú)入手，而殼聚糖發(fā)揮作用是殼聚糖-果實(shí)-病原菌三者共同相互作用的結(jié)果，因此本文從互作的角度，通過最直觀的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化來說明殼聚糖在控制采后果實(shí)病害中的作用。

1 殼聚糖與采后果實(shí)-病原菌的互作關(guān)系

病害的發(fā)生往往是病原菌與寄主相互作用的結(jié)果。病原菌侵入果實(shí)多是通過皮孔或微傷口潛入到果實(shí)內(nèi)部，在組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平可觀察到一系列的病理變化，這些變化因病原菌的寄生性的差異而不同。病原菌的致病途徑主要有破壞宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生宿主細(xì)胞壁降解酶、產(chǎn)生毒素、影響植物激素、影響宿主基因組功能等[10]。在果實(shí)-病原菌互作中，受病原菌誘導(dǎo)，引起果實(shí)體內(nèi)病組織或臨近組織中生理功能及生物能量的改變。果實(shí)有預(yù)存和誘導(dǎo)兩類防衛(wèi)系統(tǒng)。前一系統(tǒng)的成分是細(xì)胞壁的角質(zhì)、蠟質(zhì)、木質(zhì)素、栓質(zhì)、特殊氣孔結(jié)構(gòu)、小分子抗病物質(zhì)、種子預(yù)存的抗真菌蛋白和能與真菌幾丁質(zhì)結(jié)合的凝集素、破壞真菌細(xì)胞透性的蛋白質(zhì)、核糖體失活蛋白等。后一系統(tǒng)是植物的基本防衛(wèi)系統(tǒng)，它又分為局部的抗病反應(yīng)和系統(tǒng)的抗病反應(yīng)兩類。果實(shí)在抵御病原菌的過程中會發(fā)生細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變[11-12]，木質(zhì)素的產(chǎn)生，保衛(wèi)素的合成和積累，抗性酶(過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polygalacturonase，PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase，PAL))與活性氧相關(guān)酶系、編碼病程蛋白酶系、酚類物質(zhì)、其他種類物質(zhì)以及能量的變化等。通過這些形態(tài)、生理、生化水平的變化，果實(shí)才能夠抵御病原菌的侵染。

殼聚糖對果實(shí)病害的防治機(jī)制主要有：1)殼聚糖的抑菌性。目前的研究表明，酸性條件下，殼聚糖分子上的—NH2質(zhì)子化而帶正電荷，可以與帶負(fù)電的細(xì)胞或帶負(fù)電的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)相互作用，吸附在病原菌細(xì)胞表面，改變其細(xì)胞內(nèi)外正常電化學(xué)勢，影響細(xì)胞膜正常的生理功能，干擾病原菌正常的新陳代謝活動[13]；2)殼聚糖的誘導(dǎo)果實(shí)抗病性。殼聚糖在一定程度上誘導(dǎo)果蔬組織木質(zhì)素、植保素以及其他抗菌物質(zhì)(如酚類、脂肪酸等)含量升高，影響果實(shí)細(xì)胞壁、皮孔等結(jié)構(gòu)的變化，阻礙病原菌的侵襲[14]；3)殼聚糖的成膜性，殼聚糖在果實(shí)表面形成一層天然屏障，阻礙病菌的侵入，同時(shí)通過調(diào)節(jié)果實(shí)生理代謝延緩衰老，降低發(fā)病率。研究顯示，1.5%殼聚糖包膜處理草莓后果實(shí)無明顯真菌病害的發(fā)生，并顯著降低草莓的衰老[15]。這3種機(jī)制都離不開殼聚糖-果實(shí)-病原菌三者的相互作用。殼聚糖直接影響病原菌入侵的途徑，使其形態(tài)發(fā)生變化，影響其在果實(shí)組織中的發(fā)育過程，另一方面誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗性，抗性相關(guān)物質(zhì)含量增加，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化以抵御病原菌的入侵。

2 殼聚糖對果實(shí)-病原菌互作中病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

2.1 對病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的直接影響

殼聚糖對病原菌有直接抑制作用，已有的生化和超微結(jié)構(gòu)的研究都表明，殼聚糖的抑菌主要原因可能是使菌體細(xì)胞膜功能喪失(改變病原菌細(xì)胞膜的流動性和通透性)和菌體細(xì)胞壁破壞。不同分子質(zhì)量的殼聚糖對各種植物病原菌的生長以及植物病原真菌孢子萌發(fā)形成菌絲體都有明顯的抑制作用。這種抑制作用的強(qiáng)弱，因殼聚糖的分子質(zhì)量、濃度、脫乙酰度等及植物病原菌的不同而各有差異。Cheah等[16]用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察了殼聚糖處理對胡蘿卜上核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌絲的影響，發(fā)現(xiàn)菌絲形態(tài)變畸形(扭曲和分枝)、菌絲死亡(細(xì)胞質(zhì)消失)。Benhamou[17]研究了殼聚糖對引起番茄腐敗的Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici的生長、形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的影響，用光學(xué)顯微鏡觀察到殼聚糖引起菌絲膨脹和變形。Bautista-Banos等[18]報(bào)道，殼聚糖處理使病原菌菌絲膨大卷曲，被疏松的細(xì)胞壁包裹。Sánchez-Domínguez等[19]通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察到經(jīng)殼聚糖處理后A. alternata孢子和菌絲體超微結(jié)構(gòu)變化，這和殼聚糖的抑菌作用有關(guān)，病原菌發(fā)生細(xì)胞質(zhì)分裂、原生質(zhì)膜收縮、孢子崩解和質(zhì)壁分離等變化。Barka等[20]和El Hassni等[21]報(bào)道殼聚糖能使灰霉菌(Botrytis cinerea)和Fusarium oxysporum f. sp. albedinis菌絲形成大囊泡或者細(xì)胞變空失去細(xì)胞質(zhì)。對真菌孢子進(jìn)行碘化丙錠(propidium iodide，PI)染色發(fā)現(xiàn)，25℃條件下5000μg/mL殼聚糖對B.cinerea和P.expansum孢子的質(zhì)膜均有明顯的破壞作用，并且處理時(shí)間越長，質(zhì)膜損傷程度越高[22]。

殼聚糖的抑菌作用是其在病原菌細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)共同作用的結(jié)果。在細(xì)胞外，由于殼聚糖為甲殼素的多聚陽離子衍生物，能與病原菌細(xì)胞表面的生物大分子帶負(fù)電的側(cè)鏈相互作用，形成聚合物成為物理屏障，阻礙細(xì)胞內(nèi)外正常代謝和物質(zhì)交換，影響病原菌細(xì)胞膜的流動性和通透性，影響細(xì)胞質(zhì)膜完整性，造成胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，進(jìn)而抑制病原菌的生長。廖春燕[23]在殼聚糖對番茄枯萎病菌的拮抗作用研究中發(fā)現(xiàn)，0.5mg/mL殼聚糖處理1h，番茄枯萎病菌菌絲的滲透率為29.57%(對照僅5.24%)；在殼聚糖處理90min后，菌絲的電解質(zhì)滲透最為明顯。Palma-Guerrero等[24]以粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)為模型研究了殼聚糖使其質(zhì)膜滲透率增加、細(xì)胞死亡和溶胞的過程，發(fā)現(xiàn)殼聚糖使病原菌細(xì)胞滲透率增加和被吸收進(jìn)入病原菌細(xì)胞是一個(gè)耗能的過程，且不同的細(xì)胞類型(分生孢子、芽管、營養(yǎng)菌絲)對殼聚糖的敏感性不同。El Ghauth[25]報(bào)道殼聚糖處理增加了匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和B. cinerea細(xì)胞滲透率，說明細(xì)胞膜、細(xì)胞壁受到損壞。Liu Hui等[26]通過檢測培養(yǎng)基中的β-半乳糖苷酶的活性，檢測細(xì)胞滲出物在260nm波長處的吸收度以及檢測熒光探針NPN的熒光強(qiáng)度的變化等多種手段證明，殼聚糖對細(xì)胞內(nèi)膜和外膜的完整性均造成破壞。在超微結(jié)構(gòu)上，研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理對病原菌細(xì)胞的形態(tài)影響。以上研究都表明，在殼聚糖的作用下，病原菌細(xì)胞發(fā)生物質(zhì)滲漏，膜完整性受到破壞。殼聚糖目前普遍認(rèn)為大分子質(zhì)量的殼聚糖可能主要是通過在胞外發(fā)揮作用起抑菌作用的，但對細(xì)胞質(zhì)膜的破壞作用尚缺乏系統(tǒng)直觀的研究[27]。

在細(xì)胞內(nèi)，殼聚糖作為信號分子，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，或直接進(jìn)入細(xì)胞作用于胞內(nèi)物質(zhì)。Benhamou[17]在超微結(jié)構(gòu)上發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理的細(xì)胞發(fā)生質(zhì)膜變化、細(xì)胞質(zhì)顯著凝聚。Li Yongcai等[28]報(bào)道，殼聚糖處理引起細(xì)胞質(zhì)異常分布、細(xì)胞器無膜、細(xì)胞壁變厚等變化，高質(zhì)量濃度的殼聚糖能使細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞壁破裂、細(xì)胞質(zhì)流出。目前已有人將殼聚糖低聚物進(jìn)行標(biāo)記，研究殼聚糖進(jìn)入病原菌細(xì)胞后的作用，Xu Junguang等[29]提取的胞內(nèi)核酸在體外進(jìn)行凝膠阻留實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明殼寡糖能夠與DNA和RNA緊密結(jié)合，殼聚糖(尤其是低聚物)很有可能是進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)的特定靶物質(zhì)(如核酸)相互作用，引起胞內(nèi)物質(zhì)紊亂，進(jìn)而起到殺菌作用。

隨著殼聚糖的抑菌機(jī)理備受關(guān)注，雖然目前普遍認(rèn)為殼聚糖在胞外的作用是其抑菌的主要機(jī)制，但是其在胞內(nèi)的作用也不容忽視，今后應(yīng)該對其進(jìn)入細(xì)胞的方式，細(xì)胞內(nèi)存在殼寡糖的受體和作用位點(diǎn)，及其在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等進(jìn)行更深入的研究。

2.2 對病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的間接影響

殼聚糖除了有直接抑菌作用外，還能通過影響果實(shí)分泌對病原菌起拮抗作用的小分子次生代謝產(chǎn)物如植保素或抗毒素，以及能分解病原菌細(xì)胞壁的胞壁降解酶，從而對病原菌形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生間接影響。這些物質(zhì)由果實(shí)組織產(chǎn)生釋放出來，作用于病原菌細(xì)胞，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。

對病原菌作用的主要胞壁降解酶有：1)殼聚糖酶能水解病原真菌的細(xì)胞壁，抑制病原物生長，產(chǎn)生新的激發(fā)子誘導(dǎo)植物一系列防御反應(yīng)。鐘秋平[30]研究了采前噴施殼聚糖對采后接種處理毛葉棗果實(shí)腐爛的影響，得知4mg/mL殼聚糖可誘導(dǎo)毛葉棗殼聚糖酶較對照升高23.4%。2)幾丁質(zhì)酶(chitinase，CHI)的天然底物是幾丁質(zhì)，而許多植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，因而幾丁質(zhì)酶對病原菌細(xì)胞壁具有降解作用，幾丁質(zhì)酶是病程相關(guān)蛋白(PR)的重要組成部分，在植物抗病中除具有直接抑制病菌的作用外，還有從病菌壁上釋放激發(fā)子的作用。李美芹[31]測試了不同分子質(zhì)量的殼聚糖對番茄葉霉病的作用，結(jié)果表明，3、82、213kD的殼聚糖能誘導(dǎo)番茄幾丁質(zhì)酶較對照升高95.5%、263.3%、242.7%。3) β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，GLU)也是病程相關(guān)蛋白(PR)的一種，它可通過對病原菌菌絲的直接裂解作用，促進(jìn)病原菌細(xì)胞壁裂解和植物酚類物質(zhì)的合成，從而抑制病原菌的進(jìn)一步侵染[32]。李美芹[31]觀察不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對番茄葉霉病的作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3mg/mL和6mg/mL殼聚糖可誘導(dǎo)番茄β-1,3-葡聚糖酶較對照升高117.6%和428.0%。殼聚糖處理增強(qiáng)了柑橘和草莓內(nèi)CHI和GLU活性[33-34]。Meng Xianghong等[35]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理后，梨果實(shí)GLU活性明顯增加。

這些形態(tài)和物質(zhì)的變化使得病原菌失去侵染能力或者侵染力減弱，從而保護(hù)了果實(shí)組織。但是，病原菌對殼聚糖也會產(chǎn)生一些防御反應(yīng)，如形成子菌絲的細(xì)胞質(zhì)變稠密，細(xì)胞壁變厚等。Benhamou[17]發(fā)現(xiàn)了病原菌細(xì)胞中幾丁質(zhì)等非結(jié)晶的物質(zhì)發(fā)生異常沉積，β-1,3-葡聚糖酶和脫乙酰幾丁質(zhì)酶活性增強(qiáng)。幾丁質(zhì)等物質(zhì)合成增加的生理學(xué)意義可能是平衡細(xì)胞壁改變和質(zhì)膜逐漸收縮所形成的壓力。

雖然不同研究者從各個(gè)角度探討了特定分子特征殼聚糖對不同種屬病原微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理代謝的影響，但缺乏系統(tǒng)性的研究。今后應(yīng)在利用熒光或膠體金標(biāo)記殼聚糖研究其作用部位以及對細(xì)胞膜的影響方面加強(qiáng)研究[27]。

3 殼聚糖對果實(shí)-病原菌互作中果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

3.1 對果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的直接影響

果實(shí)的細(xì)胞壁可以維持細(xì)胞具有一定形狀，還可以保護(hù)原生質(zhì)體，對外界病原菌微生物的入侵具有一定的抵抗作用。它是植物抵御外來侵染的第一道有效屏障，當(dāng)病原物侵染時(shí)，細(xì)胞壁部分被破壞，誘使植物細(xì)胞對細(xì)胞壁進(jìn)行修復(fù)，加速非蛋白性物質(zhì)在細(xì)胞壁的沉積，細(xì)胞壁加厚并木質(zhì)化。果實(shí)在受到病原微生物侵染時(shí)，在菌絲與寄主細(xì)胞接觸的寄主細(xì)胞與質(zhì)膜之間，常有胞壁沉積物的形成，它是抵抗病原菌侵染的重要防衛(wèi)系統(tǒng)之一，并且增強(qiáng)了寄主細(xì)胞壁對病菌入侵的抵御能力，沉積物中往往存在著大量的纖維素、半乳糖、β-1,3-葡聚糖等成分。殼聚糖處理能使果實(shí)果皮細(xì)胞壁變厚，促進(jìn)木質(zhì)化，更利于抵御病原菌的入侵。Nicole等[36]用殼聚糖處理番茄，當(dāng)鐮刀菌入侵時(shí)，番茄細(xì)胞壁顯著加厚，胞間被填塞。

寄主植物在受到病原菌侵染時(shí)，寄主細(xì)胞在侵染點(diǎn)處要分泌類似于胞壁沉積物的物質(zhì)，即乳突結(jié)構(gòu)，一般位于植物細(xì)胞壁與質(zhì)膜之間。乳突的形成與病原菌的侵染密切相關(guān)，乳突可能具有物理的和化學(xué)的抑制病菌入侵的作用，即乳突性。Nicole等[36]用研究發(fā)現(xiàn)用殼聚糖處理的番茄，果皮細(xì)胞在病菌侵入處形成大量乳頭狀突起，病原菌被包埋在致密的顆粒狀物質(zhì)中，不能進(jìn)一步擴(kuò)散，而且顆粒狀物質(zhì)中似乎還有殺菌物質(zhì)產(chǎn)生，使植物對病原菌產(chǎn)生了有效的抗性。

木質(zhì)素是一種重要的物理抗菌物質(zhì)，它的形成和松柏醇產(chǎn)生的甲基化醌與HRGP之間的共價(jià)交換有關(guān)，植物抗病激活劑的誘導(dǎo)導(dǎo)致木質(zhì)素在細(xì)胞壁沉積而構(gòu)成致密、不易穿透的屏障，阻止了病菌的生長繁殖，從而保護(hù)細(xì)胞免受侵害[37]。木質(zhì)素是由4種醇單體(對香豆醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇)形成的一種復(fù)雜的酚類化合物，它與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成植物骨架的主要成分，木質(zhì)素沉積于細(xì)胞壁，并以共價(jià)鍵與細(xì)胞壁結(jié)合。鐘秋平[30]在研究采前噴施殼聚糖對提高毛葉棗抗病能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，殼聚糖處理的果實(shí)在整個(gè)成熟過程中木質(zhì)素含量都明顯高于對照，木質(zhì)素含量隨著果實(shí)成熟度的增加而逐漸增加。研究表明[38]，殼聚糖處理的馬鈴薯塊莖中黃酮類物質(zhì)和木質(zhì)素含量增加。PAL是苯基丙酸類合成路徑的第一個(gè)酶，并和酚類化合物、植保素、木質(zhì)素合成有關(guān)。有報(bào)道[39]，殼聚糖處理后的小麥葉中PAL的活性、木質(zhì)素的含量都有所上升。Vasconsuelo等[40]也在歐茜草細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)殼聚糖可誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁木質(zhì)化。

富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)是高等植物中特有的一種結(jié)構(gòu)蛋白，其特點(diǎn)是羥脯氨酸含量高達(dá)30%～40%，HRGP可在被各種病原物侵染的植物中積累，也可被各種誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)。HRGP也是細(xì)胞壁中木質(zhì)素沉積的位點(diǎn)，木質(zhì)素也是植物體內(nèi)的一種重要的物理抗菌物質(zhì)，它與HRGP一起作為結(jié)構(gòu)屏障物，起加固細(xì)胞壁的作用。周自云等[41]用0.1mL 30%殼聚糖誘導(dǎo)楊樹愈傷組織，發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理的愈傷組織HRGP含量呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢，在殼聚糖處理96h后含量達(dá)最高(74μg/mg)，較空白對照增加了1.1倍。

據(jù)報(bào)道[42]，殼聚糖能誘導(dǎo)侵染局部和整個(gè)植株系統(tǒng)性發(fā)生一系列反應(yīng)，包括信號傳遞、病原相關(guān)蛋白及抗菌成分的聚集和激活。殼聚糖在植物體內(nèi)誘導(dǎo)作用的機(jī)制可能分為2步，首先，植物組織細(xì)胞內(nèi)具有識別和接受殼聚糖刺激信號的特殊受體，對殼聚糖進(jìn)行分子識別，通過構(gòu)型變化激活胞內(nèi)有關(guān)酶的活性；其次修飾胞內(nèi)基質(zhì)后產(chǎn)生激活性和適應(yīng)性的信號分子，并通過對特殊基因的調(diào)節(jié)激發(fā)組織細(xì)胞產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。除了誘導(dǎo)果實(shí)生成抗性相關(guān)物質(zhì)外，殼聚糖處理還引起果實(shí)體內(nèi)形態(tài)學(xué)上的變化，通過促進(jìn)果實(shí)木質(zhì)素、植保素的合成來增加果實(shí)細(xì)胞壁抗真菌穿透的能力，從而提高果實(shí)的抗病反應(yīng)能力。另外，殼聚糖處理果實(shí)后，經(jīng)常會在侵入點(diǎn)附近黏著，此現(xiàn)象的主要功能除了形成物理屏障外，還能引起周圍組織發(fā)生過敏反應(yīng)，并伴隨有H2O2的積累，誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁增厚，這對植物其他健康組織是一個(gè)警示信號[43]。

3.2 對果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的間接影響

病原菌穿過細(xì)胞壁是通過分泌細(xì)胞壁水解酶直接突破果實(shí)表皮防御機(jī)制，造成細(xì)胞壁果膠、纖維素等的降解，引起果皮組織結(jié)構(gòu)塌陷、崩解，借此力量侵入宿主細(xì)胞，并通過降解的植物細(xì)胞壁多聚體成分獲得養(yǎng)分。根據(jù)酶作用的底物，可將病原菌分泌的細(xì)胞壁水解酶分為以下幾種：角質(zhì)酶(Cutinase)破壞植物體表面的角質(zhì)層；果膠酶(Pectinase)破壞植物細(xì)胞的中膠層，其中果膠酶包括多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)、果膠甲酯酶(PMG)以及果膠裂解酶(Pectate lyase，PE)等；纖維素酶(Cellulase)降解細(xì)胞壁纖維絲；半纖維素酶(Hemicellulase)；蛋白酶(Protease)，蛋白質(zhì)可作為細(xì)胞膜成分和植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，因此寄主蛋白質(zhì)被病原物質(zhì)分泌的蛋白酶降解可嚴(yán)重影響到寄主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。殼聚糖處理會影響病原菌胞壁降解酶的分泌，從而間接保護(hù)果實(shí)果皮的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

El Ghaouth等[44]研究了殼聚糖處理對B.cinerea侵入甜柿子椒的過程的影響，特別是對病原菌降解果實(shí)細(xì)胞壁成分的影響。他們從B.cinerea感染組織中分離出了細(xì)胞壁組織浸解酶，這些酶和宿主細(xì)胞降解及果膠減少有關(guān)，其中果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶對病害發(fā)生有重要意義[45]，B.cinerea的主要生長方式是寄生，因此生成PG等酶和有機(jī)酸從而降解宿主細(xì)胞是它寄生的重要機(jī)制[46]。果膠降解被認(rèn)為是其他細(xì)胞壁多聚物降解的前提[45]，在感染組織中，PG活性升高，纖維素酶活性未顯著升高，但是果膠顯著減少、纖維素降解，表明病原菌產(chǎn)生的酶降解了果膠多糖類物質(zhì)。研究中經(jīng)殼聚糖處理后，一方面宿主細(xì)胞壁果膠結(jié)合位點(diǎn)和纖維素的緊密規(guī)律排列受到保護(hù)，另一方面殼聚糖能使B.cinerea減少產(chǎn)生PG，從而阻止菌絲通過損傷宿主細(xì)胞而侵入果實(shí)體內(nèi)，阻止了B.cinerea對果實(shí)的傷害。

4 結(jié) 語

綜上所述，殼聚糖通過和病原菌-果實(shí)的相互作用來控制果實(shí)病害，在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，主要表現(xiàn)在：1)殼聚糖具有直接抑菌作用，通過在病原菌胞內(nèi)和胞外的共同作用，影響其細(xì)胞質(zhì)膜完整性，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生改變，胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，孢子、菌絲等形態(tài)發(fā)生變化，從而無法正常生長；2)殼聚糖通過誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生對病原菌的胞壁降解酶，使病原菌發(fā)生形變，無法繼續(xù)侵入果實(shí)組織，最終被殺死；3)殼聚糖能誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生抗病性，除了誘導(dǎo)產(chǎn)生一些抗性物質(zhì)以外，還能使果實(shí)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)抗性，即組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變以抵御病原菌的入侵；4)病原通過分泌一些胞壁降解酶侵入果實(shí)細(xì)胞，殼聚糖能夠抑制這些酶的產(chǎn)生，防止對果實(shí)細(xì)胞組織造成形態(tài)結(jié)構(gòu)上的損害，從而保護(hù)果實(shí)組織不受病原菌的感染。在殼聚糖-果實(shí)-病原菌三者關(guān)系中，存在多層次的影響和作用，其中任何一個(gè)出現(xiàn)質(zhì)和量的變化都可能引發(fā)整個(gè)作用機(jī)制的變化，而且由于其生理生化影響變化在先，結(jié)構(gòu)變化在后，因此以形態(tài)結(jié)構(gòu)水平研究為基礎(chǔ)，深入開展生理生化及代謝途徑變化等相關(guān)研究，說明引發(fā)結(jié)構(gòu)變化的深層次原因，是今后研究的重點(diǎn)和關(guān)鍵。

殼聚糖對植物病原菌抑菌機(jī)理是十分復(fù)雜的，要經(jīng)過一系列復(fù)雜的過程且抑菌程度有限。在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中僅僅依靠殼聚糖類誘抗劑的作用并不能有效控制病害的發(fā)生?，F(xiàn)階段殼聚糖類物質(zhì)與傳統(tǒng)保鮮方法的復(fù)合使用是更為有效的方法。其中，殼聚糖和拮抗菌復(fù)合使用是當(dāng)下生物防治領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)：El Ghaouth等[47]研究表明采后拮抗酵母Candida saitoana與殼聚糖衍生物聯(lián)合處理能對蘋果青霉病和灰霉病及柑橘綠霉病產(chǎn)生協(xié)同增效的控制效果。Sharma等[48]研究顯示，酵母Candida utilis與殼聚糖配合使用對番茄果實(shí)病原菌Alternaria alternata和Geotrichum candidum的拮抗效力顯著提高。

殼聚糖具有抗病譜廣、持續(xù)時(shí)間較長、對環(huán)境無污染以及有效作用濃度低等特點(diǎn)，因而在果蔬病害控制方面具有良好的應(yīng)用前景。由于基因工程技術(shù)、純化和有機(jī)合成技術(shù)的發(fā)展，殼聚糖對果實(shí)-病原菌互作的影響及它在果實(shí)采后病害防治中的機(jī)理也將愈來愈清楚，殼聚糖等生物性殺菌劑在一定程度上替代化學(xué)農(nóng)藥將在農(nóng)作物病害安全控制的領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

[1] El GHAOUTH A, ARUL J, PONNAMPALAM R, et al. Chitosan coating effect on storability and quality of fresh strawberries[J]. Journal of Food Science, 1991, 56： 1618-1621.

[2] ZHANG D, QUANTICK P C. Antifungal effects of chitosan coating on fresh strawberries and raspberries during storage[J]. Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 1998, 73： 763-767.

[3] BAUTISTA-BANOS S, de LUCCA A J, WILSON C L. Evaluation of the antifungal activity of natural compounds to reduce postharvest blue mould (Penicillium expansum Link.) of apples (Malus domestica Borkh.) during storage[J]. Mexican Journal of Phytopathology, 2004, 22： 362-369.

[4] DU J, GEMMA H, IWAHORI S. Effects of chitosan coating on the storage of peach, Japanese pear and kiwifruit[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 1997, 66： 15-22.

[5] de CAPDEVILLE G, WILSON C L, BEER S V, et al. Alternative disease control agents induce resistance to blue mold in harvested ‘Red Delicious’ apple fruit[J]. Phytopathology, 2002, 92： 900-908.

[6] ROMANAZZI G, NIGRO F, IPPOLITO A. Short hypobaric treatments potentiate the effect of chitosan in reducing storage decay of sweet cherries[J]. Postharvest Biology and Technology, 2003, 29： 73-80.

[7] GUO Zhanyong, CHEN Rong, XING Ronge, et al. Novel derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro[J]. Carbohydrate Research, 2006, 341： 351-354.

[8] PENG Yanfei, HAN Baoqin, LIU Wanshun, et al. Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan[J]. Carbohydrate Research, 2005, 340： 1846-1851.

[9] 徐霞, 雷萬學(xué), 李正軍, 等. 殼聚糖季銨鹽衍生物的合成及其抗菌活性[J]. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版, 2006, 19(1)： 58-60.

[10] 王艷娜. 鴨梨果實(shí)輪紋病寄主-病原菌互作機(jī)理[D]. 北京： 中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2007.

[11] PRING R J. A fine-structural study of the infection of leaves of Phaseolus vulgaris by uredospores of Uromyces phaseoli[J]. Physiological Plant Pathology, 1980, 17： 269-276.

[12] YE X S, DEVERALL B J. Effects of heat treatment or mixed inoculation on the development of compatible and incompatible bean rust infections[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1989, 34： 427-437.

[13] EWEIS M, ELKHOLY S S, ELSABEE M Z. Antifungal efficacy of chitosan and its thiourea derivatives upon the growth of some sugarbeet pathogens[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2006, 38： 1-8.

[14] BAUTISTA-BANOS S, HERNANDEZ-LOPEZ M, BOSQUEZMOLINA E, et al. Effects of chitosan and plant extracts on growth of Colletotrichum gloeosporioid, anthracnose levels and quality of papaya fruit[J]. Crop Protection, 2003, 22： 1087-1092.

[15] HERNANDEZ-MUNOZ P, ALMENAR E, OCIO M J, et al. Effect of calcium dips and chitosan coatings on postharvest life of strawberries(Fragaria × ananassa)[J]. Postharvest Biology and Technology, 2006, 39： 247-253.

[16] CHEAH L H, PAGE B B C, SHEPERD R. Chitosan coating for inhibition of sclerotinia rot of carrots[J]. Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 1997, 25： 89-92.

[17] BENHAMOU N. Ultrastructural and cytochemical aspects of chitosan on Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, agent of tomato crown and root rot[J]. Phytopathology, 1992, 82： 1185-1193.

[18] BAUTISTA-BANOS S, HEMANDEZ-LOPEZ M, BOSQUEZ- MOLINA E. Growth inhibition of selected fungi by chitosan and plant extracts[J]. Mexican Journal of Phytopathology, 2004, 22： 178-186.

[19] SáNCHEZ-DOMíNGUEZ D, RíOS M Y, CASTILLO-OCAMPO P, et al. Cytological and biochemical changes induced by chitosan in the pathosystem Alternaria alternate-tomato[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2011, 99： 250-255.

[20] BARKA E, EULLAFFROY P, CLEMENT C, et al. Chitosan improves development, and protects Vitis vinifera L. against Botrytis cinerea[J]. Plant Cell Report, 2004, 22： 608-614.

[21] El HASSNI M, El HADRAMI A, DAAYF F, et al. Chitosan, antifungal product against Fusarium oxysporum f. sp. albedinis and elicitor of defence reactions in date palm roots[J]. Phytopathology Mediterr, 2004, 43： 195-204.

[22] LIU Jia, TIAN Shipin, MENG Xianghong, et al. Effects of chitosan on control of postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2007, 44： 300-306.

[23] 廖春燕. 殼聚糖誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)及機(jī)制研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué), 2002： 21-47.

[24] PALMA-GUERRERO J, HUANG I C, JANSSON H B, et al. Chitosan permeabilizes the plasma membrane and kills cells of Neurospora crassa in an energy dependent manner[J]. Fungal Gen Biol, 2009, 46： 585-594.

[25] El GHAUTH A, ARUL J, ASSENLIN A, et al. Antifungal activity of chitosan on post-harvest pathogens： induction of morphological and cytological alterations in Rhizopus stolonifer[J]. Mycol Res, 1992, 96： 769-779.

[26] LIU Hui, DU Yumin, WANG Xiaohui, et al. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 95： 147-155.

[27] 楊玲玉, 孟祥紅, 劉成圣, 等. 殼聚糖的抗菌性及其對果實(shí)病害的防治研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(2)： 626-635.

[28] LI Yongcai, SUN Xiaojuan, BI Yang, et al. Antifungal activity of chitosan on Fusarium sulphureum in relation to dry rot of potato tuber[J]. Agricultural Sciences in China, 2009, 8(5)： 597-604.

[29] XU Junguang, ZHAO Xiaoming, WANG Xiuli, et al. Oligochitosan inhibits Phytophthora capsici by penetrating the cell membrane and putative binding to intracellular targets[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2007, 88： 167-175.

[30] 鐘秋平. 殼聚糖、1-MCP處理對熱帶水果保鮮的研究[D]. 無錫： 江南大學(xué), 2006： 82-96.

[31] 李美芹. 殼聚糖抑制番茄葉霉病菌的活性與誘導(dǎo)抗性及其機(jī)理研究[D]. 青島： 中國海洋大學(xué), 2007： 69-86.

[32] GAUDOT E D, SLEZACK S, DASSI B, et al. Plant hydrolytic enzymes(chitinases and β-1,3-glucanase)in root reactions to pathogenic and symbiotic microorganisms[J]. Plant and Soil, 1996, 185： 211-221.

[33] BAUTISTA-BANOS S, HERNáNDEZ-LAUZARDO A N, VELáZQUEZ-DEL VALLE M G, et al. Chitosan as a potential natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural commodities[J]. Crop Prot, 2006, 25(2)： 108-118.

[34] FAJARDO J E, MCCOLLUM T G, MCDONALD R E, et al. Differential induction of proteins in orange flavedo by biologically based elicitors and challenged by Penicillium digitatum Sacc[J]. Biological Control, 1998, 13： 143-151.

[35] MENG Xianghong, YANG Lingyu, KENNEDY J F, et al. Effects of chitosan and oligochitosan on growth of two fungal pathogens and physiological properties in pear fruit[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 81： 70-75.

[36] NICOLE B, GEORGES T. Treatment with chitoson enbances resistance of tomato plants to the crown plants to the crown and root rot pathogen Fusarinm oxysporum f. sp. Radicis-lycopersici[J]. Physiol Mol Plant Pathol, 1992, 41： 33-52.

[37] 趙小明. 殼寡糖誘導(dǎo)植物抗病性及其誘抗機(jī)理的初步研究[D]. 大連： 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 2006： 119-132.

[38] SHADLE G L, WESLEY S V, KORTH K L, et al. Phenylpropanoid compounds and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of L-phenylalanine ammonia-lyase[J]. Phytochemistry, 2003, 64： 153-161.

[39] VANDER P, VARUM K M, DOMARD A, et al. Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in wheat leaves[J]. Plant Physiology, 1998, 118： 1353-1359.

[40] VASCONSUELO A, GIULETTI A M, PICOTTO G, et al. Involvement of the PLC/PKC pathway in chitosan-induced anthraquinone production by Rubia tinctorum L. cell cultures[J]. Plant Science, 2003, 165(2)： 429-436.

[41] 周自云, 胡景江, 王俊明. 幾種激發(fā)子對楊樹愈傷組織保護(hù)酶活性的誘導(dǎo)作用[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 21(1)： 1126-1132.

[42] El HADRAMI A, ADAM L R, El HADRAMI I, et al. Chitosan in plant protection[J]. Marine Drugs, 2010, 8： 968-987.

[43] 張怡, 劉嚴(yán), 康靜敏, 等. 殼聚糖誘導(dǎo)植物抗病機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 14： 82-85.

[44] El GHAOUTH A, ARUL J, WILSON C, et al. Biochemical and cytochemical aspects of the interactions of chitosan and Botrytis cinerea in bell pepper fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 1997, 12： 183-194.

[45] JOHNSTON D J, WILLIAMSON B. Purification and characterization of four polygalacturonases from Botrytis cinerea[J]. Mycol Res, 1992, 96： 343-349.

[46] VERHOEFF K, LEEMAN M, van PEER R, et al. Changes in pH and the production of organic acids during colonization of tomato petioles by Botrytis cinerea[J]. J Phytopathol, 1988, 122： 327-336.

[47] El GHAOUTH A, SMILANICK J L, WILSON C L. Enhancement of the performance of Candida saitoana by the addition of glycolchitosan for the control of postharvest decay of apple and citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2000, 19： 103-110.

[48] SHARMA N, VERM U, AWASTHI P. A combination of yeasts Candida utilis and chitosan controls fruit rot in tomato caused by Alternaria alternate(Fr.)Keissler and Geotrichum candidum Link ex Pers[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 2006, 81： 1052-1056.