鹽酸克倫特羅檢測方法的研究進展

王秋平，哈 婧，劉 碩，張佳麗，蘇 萌

（河北科技大學化學與制藥工程學院，河北石家莊 050018）

鹽酸克倫特羅俗稱瘦肉精，為白色結(jié)晶性粉末，可促進動物生長，改善動物體內(nèi)脂肪分配，增加瘦肉率；其易被動物吸收，在動物體內(nèi)殘留時間長，容易蓄積［1］。人類食用含有鹽酸克倫特羅的肉后會出現(xiàn)心跳過快、四肢肌肉顫動等中毒癥狀。由于一般的烹調(diào)方法不能將豬臟器和肉中殘留的“瘦肉精”的毒性破壞或損耗，以致殘留的鹽酸克倫特羅超量而引起的食物中毒事件屢有發(fā)生［2－3］。雖然中國已禁止其作為生長促進劑使用，但有些不法分子仍在違規(guī)使用，影響了中國畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量，對人們的食用安全造成嚴重危害。因此，研究動物組織中鹽酸克倫特羅殘留量快速、靈敏的檢測方法對保障人們的食用安全具有重要意義。

目前已用于鹽酸克倫特羅檢測的方法主要有免疫分析法、色譜分析法及各種聯(lián)用技術(shù)分析法等。有關(guān)鹽酸克倫特羅殘留檢測的國標方法有3種，分別為酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）。

1 免疫分析法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）

ELISA 測定鹽酸克倫特羅殘留量是利用抗原抗體的特異性反應，以酶催化底物等方法作為顯示系統(tǒng)，用微孔板等作為反應、分離載體的一種生物學檢測方法，是快速篩選檢測動物肌肉、尿液、肝臟等樣品中鹽酸克倫特羅殘留的方法之一。陳穗等用ELISA 對樣品檢測，定性檢出克倫特羅的質(zhì)量濃度（以下文中如無特別說明，均用質(zhì)量濃度表示鹽酸克倫特羅或克倫特羅的實驗結(jié)果）為0.03ng／mL，定量檢測結(jié)果為0.1ng／mL；在0.1～8.1ng／mL 范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.991 3；當克倫特羅標準品添加水平分別為0.5，1.0ng／mL 時，平均回收率分別為84%，90%［4］。上述指標均符合殘留分析質(zhì)量控制的要求。謝炯炯等測定豬肝、豬尿中違禁藥物克倫特羅殘留量影響的實驗結(jié)果表明，北京望爾生物技術(shù)有限公司與德國拜發(fā)公司生產(chǎn)的2種ELISA 試劑盒具有操作簡單、敏感度高、成本低、時間短等特點［5］。

ELISA 是酶免疫分析法（EIA）中較高效的技術(shù)，能在短短幾小時內(nèi)檢測上百個樣品，且不需要復雜的儀器設備，具有樣品前處理簡單、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點；但常用的ELISA 的檢出限與鹽酸克倫特羅的允許最大殘留量均為0.1μg／kg（質(zhì)量分數(shù)），因此ELISA 難以達到檢測要求。

1.2 化學發(fā)光酶免疫分析法（CLEIA）

化學發(fā)光酶免疫分析方法將高靈敏度的化學發(fā)光和高特異性的免疫分析結(jié)合起來，具有成本低、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。RODA 等采用間接競爭化學發(fā)光酶免疫分析法對豬尿樣中的鹽酸克倫特羅進行了檢測，檢測靈敏度分別為0.08μg／L，但方法只限于豬尿樣中鹽酸克倫特羅的測定［6］。徐曉嬰等優(yōu)化了檢測方法的反應溫度、反應時間、緩沖體系的pH 值、離子強度、Tween－20 的濃度等參數(shù)，該方法的理論檢測限為0.001 4μg／L，線性檢測范圍可達到0.04～42.5μg／L。批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于10%，回收率為95%～110%，同時有較高的特異性；優(yōu)化后的檢測方法可適用于大濃度范圍內(nèi)的檢測，并且此方法完全符合鹽酸克倫特羅殘留檢測的要求［7］。王碩等建立了直接競爭化學發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中鹽酸克倫特羅殘留，檢測時間較ELISA節(jié)省了近30min，靈敏度可達0.02μg／kg（質(zhì)量分數(shù)），平均回收率為83%～98%，可用于實際豬肉樣品中鹽酸克倫特羅殘留的快速檢測，同時不受萊克多巴胺、沙丁胺醇等同屬β－興奮劑類的違禁獸藥的影響；該方法操作步驟較少、樣品前處理簡便、準確度高、所需設備易于普及，具有一定的應用潛力［8］。

1.3 滴金免疫技術(shù)（DIGFA）

應用競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的鹽酸克倫特羅在流動的過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和鹽酸克倫特羅蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合。如果檢測樣本反應的顏色淺于標準檢測線的顏色，結(jié)果為陽性。顏色越淺表示含量越高。張慧嫦等建立的膠體金免疫層析法可用于快速檢測組織樣品中鹽酸克倫特羅殘留量，檢測豬肉等組織試樣時，結(jié)果以顏色直觀顯示，最低靈敏度值可達到0.5ng／mL，只需3～5min，與萊克多巴胺、沙丁胺醇的交叉反應率為0.86%［9］。目前國內(nèi)已有多家公司開發(fā)出商品化的鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條［10］。

此法檢測鹽酸克倫特羅操作簡便、觀察直觀，適用于批量篩選、宰前檢疫等現(xiàn)場檢測，且操作過程儀器化低［11］，解決了過去不能現(xiàn)場檢測定性和及時進行處理的難題，具有良好的應用前景。

1.4 生物傳感器法（BS）

生物傳感器是將生物感應元件的專一性、敏感性與一個能夠產(chǎn)生和待測物濃度成比例信號的傳導器結(jié)合，利用各種生物材料或生物代謝產(chǎn)物如酶、抗體等做成的用于檢測、識別食品與生物的化學成分的傳感器［12］。呂會田等應用生物化學和免疫學方法，構(gòu)建了基于量子點標記的ATP 合酶分子馬達免 疫 旋 轉(zhuǎn) 生 物 傳 感 器（immuno－rotary biosensor，IRB），結(jié)合熒光技術(shù)，利用中國科學院生物物理研究所張仲倫老師研發(fā)的BPCL 弱光檢測器實現(xiàn)了對鹽酸克倫特羅的檢測，該法快速、感應靈敏度可達10－12g／L（文獻值一般為10－9g／L）［13］。

國外已有生物傳感器技術(shù)檢測鹽酸克倫特羅殘留，該技術(shù)實現(xiàn)了超微量檢測的可能，大大加快了檢測速度，使得對鹽酸克倫特羅的檢測向全自動無試劑檢測方向更近了一步。

1.5 放射免疫分析法（RIA）

RIA是一種對微生物受體進行標記，將RIA 和ELISA、生物發(fā)光技術(shù)、化學發(fā)光技術(shù)相結(jié)合進行檢測的新型檢測技術(shù)［14］，檢測限可達到0.5ng／mL的水平。目前國外已有RIA測定CL的試劑盒產(chǎn)品［15］。

放射免疫分析技術(shù)雖然具有操作簡便、特異性強、靈敏度高、易標準化等優(yōu)點。但是由于所用儀器較昂貴，對實驗條件要求較苛刻，必須使用放射性同位素標記鹽酸克倫特羅，且放射性同位素對人體有一定的傷害，從而限制了該法的廣泛應用，不屬于目前主要的分析方法。

1.6 時間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA）

以稀土元素為信號放大標記物，結(jié)合抗原抗體反應的特異性和Eu3＋標記信號的高靈敏度，可以實現(xiàn)違禁藥物的痕量檢測。樊曉博等建立Eu3＋標記抗原直接競爭TRFIA，以自制鹽酸克倫特羅單克隆抗體包被96 孔微孔板作為固相抗體，Eu3＋標記抗原與樣品中的CBL競爭結(jié)合抗體，建立直接競爭熒光免疫分析體系；組織、豬尿樣品添加回收率實驗結(jié)果：樣品回收率為91%～101%；方法靈敏度為0.02 μg／L，與萊克多巴胺、沙丁胺醇、馬不特羅等結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應率均小于1%，說明抗體特異性較強［16］。鹽酸克倫特羅Eu3＋標抗原直接競爭時間分辨免疫檢測法操作簡單、靈敏度高、特異性強，可以完全符合現(xiàn)有實際檢測需求。

與放射免疫分析法（RIA）相比，時間分辨熒光免疫分析技術(shù)具有很多優(yōu)點：靈敏度高（10－19mol／L），穩(wěn)定性好，克服了放射性熒光物質(zhì)的不穩(wěn)定性，動態(tài)范圍寬，無放射性危害等，時間分辨熒光分析技術(shù)目前被公認為是靈敏度最高的分析方法之一。

2 色譜分析法

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC法分析鹽酸克倫特羅時不需要衍生化，利用反相C8或C18色譜柱檢測β－激動劑類物質(zhì)。張群等采用固相萃取柱過柱凈化，固定相為ODS－C18，流動相為0.02mol／L磷酸二氫鈉緩沖液（pH 值為6.0）－甲醇（體積比為60∶40），流速為0.8mL／min，進樣量為10μL，二極管陣列檢測器，檢測波長為210nm，利用峰面積進行多點標準法定量。線性濃度范圍為0.01～1.0μg／mL，相關(guān)系數(shù)為0.998 9，檢測限為0.01μg／mL［17］。

中國已將HPLC 法作為檢測鹽酸克倫特羅殘留的半確證方法。其優(yōu)點是檢測假陽性率低、精確度高、成本低、速度快，適合大批量快速檢測。最低檢測限為1～15ng／g（質(zhì)量分數(shù)），而且與GC－MS法相比樣品不必衍生化，是目前較常用、較成熟的檢測方法。

2.2 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法是最常用的鹽酸克倫特羅測定方法，現(xiàn)作為中國測定動物組織中鹽酸克倫特羅的確證性方法（NY／T468－2001），具有準確度高、靈敏度高、假陽性率低等特點。

王培龍等利用分子印記聚合物（MIP）的分子識別能力，選擇性提取、凈化并富集豬尿液中的鹽酸克倫特羅成分，同時除去干擾物，減少基體抑制作用；用N，O－雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，毛細管氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（選擇離子模式，選擇離子為277，262，243和86）對衍生物分析；不同鹽酸克倫特羅加入量的回收率為71.0% ～89.3%；檢出限為0.51μg／L，定量限為1.00μg／L；相對標準偏差為3.2%～9.7%，重復性良好［18］。林維宣等建立了動物組織中10 種β－興奮劑殘留量的GC－MS檢測方法；樣品經(jīng)pH 值為5.2的乙酸鈉溶液提取，提取液依次經(jīng)異丙醇－乙酸乙酯（體積比為40∶60）混合溶劑和異丙醇－叔丁基甲醚（體積比為1∶5）混合溶劑萃取凈化，再經(jīng)Strata－X－C 陽離子交換柱（500mg，3mL）凈化后，m（TMCS）∶m（BSTFA）為1∶99 的衍生劑衍生，采用HP－5MS 色譜柱進行GC－MS法分析，兼顧各成分靈敏度的情況下，優(yōu)化質(zhì)譜的一系列條件，建立了最佳質(zhì)譜分析條件；10種β－興奮劑類獸藥室內(nèi)平均回收率為59.1%～77.4%，變異系數(shù)為0.87%～7.04%，檢出限為1～5μg／kg（質(zhì)量分數(shù)）；方法的回收率、檢測限和精密度等技術(shù)指標滿足國內(nèi)外對β－興奮劑殘留量檢測的有關(guān)要求［19］。

GC－MS與HPLC法相比，假陽性率更低，可以準確地在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析；但其衍生化操作繁瑣，增加了結(jié)果的不確定度，使得GC－MS的應用受到一定限制。

2.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS－MS）

LEHNER 等采用250 mm×2 mm 的Luna phenyl柱子，用含0.05%（體積分數(shù)，下同）甲酸和5%（體積分數(shù)，下同）的乙腈水及含0.05%甲酸的乙腈為流動相，在0.45mL／min的流速下進行梯度洗脫，使用ESI－MS／MS檢測器進行多反應檢測，檢測母離子質(zhì)荷比（m／z）為277，子離子m／z為277，259，204，64的產(chǎn)物離子，氘代的克倫特羅作為內(nèi)標物，檢測限可達4pg／mL［20］。汪輝等建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定加工肉制品中萊克多巴胺和克倫特羅的方法；采用陽離子交換色譜柱（SCX）分離目標化合物，改進了前處理方法，采用PXC 固相萃取柱凈化，并對洗脫溶液和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的各參數(shù)進行優(yōu)化；檢出限和定量下限分別不超過0.04μg／kg（質(zhì)量分數(shù)）和0.015μg／kg（質(zhì)量分數(shù)）。樣品平均加標回收率為72%～98%。質(zhì)譜檢測器靈敏度高，特異性好，可應用于加工肉制品中獸藥殘留的批量檢測［21］。

2.4 高效薄層色譜法（HPTLC）

高效薄層色譜法已成功應用于肉食品中獸藥殘留的檢測，并能進行定性定量研究［22］。黃寶華等采用薄層掃描法測定豬肝中克倫特羅殘留量，展開劑為m（乙酸乙酯）∶m（甲醇）∶m（醋酸）為8∶1∶0.8，GF254板為載體，克倫特羅的Rf值為0.81。線性范圍為0.004～0.050μg，回收率為86.5%～94.9%，RSD 值為5.0%～5.8%（n＝6）［23］。該法優(yōu)點是多樣品同時一次測定，快速且高效，分離出的樣品可進行其他驗證分析；缺點是樣品準備時間長，抗干擾能力弱［24］。

2.5 毛細管電泳法（CE）

有學者采用10mmol／L硼酸緩沖溶液（pH 值為10.0），溫度為32 ℃，分離電壓為19kV，檢測波長為205nm；同時檢測人尿液中4種被分析物，約用1min，未發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾；檢測限為0.5mg／L，線性范圍2.0～30mg／L，相關(guān)系數(shù)大于0.996［25］。李春宇采用緩沖液為15 mmol／L 的磷酸鹽緩沖液（磷酸調(diào)pH 值為6.5），運行電壓25kV，柱溫為25℃，檢測波長為200nm；檢測結(jié)果：克倫特羅線性范圍為0.000 56～0.013 44mg／mL（r＝0.999 8），加樣回收率（n＝6）為99.83%（RSD＝1.17% ）［26］。該法可快速、簡便有效地檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的含量。

3 其他分析方法

宋詩穩(wěn)等以自制納米CeO2修飾碳糊電極建立了微分脈沖伏安法對鹽酸克倫特羅的測定；方法檢出限為2.5×10－9mol／L，線性范圍為5.0×10－9～6.0×10－6mol／L（r＝0.998 2，n＝7），加標回收率為96%～104%［27］。高錳酸鉀在多聚磷酸條件下與甲醛產(chǎn)生化學發(fā)光，鹽酸克倫特羅能大大增強該發(fā)光強度，ZHOU 等基于分子印記技術(shù)在線富集克倫特羅，通過流動注射化學發(fā)光檢測其含量，檢測限為3.0 × 10－10g／mL，線性范圍為1.0 × 10－9～5.0×10－8g／mL，RSD≤5%（n＝3）［28］。胡玉斐建立起一種直接測定鹽酸克倫特羅的流動注射化學發(fā)光分析法，檢出限為1.2×10－8g／mL，但此法抗干擾能力弱，還需進一步確證［29］。

4 結(jié) 語

目前ELISA 是快速篩選檢測動物肌肉、尿液、肝臟等樣品中克倫特羅殘留的方法之一，ELISA 方法操作簡單、快速，通常用作大規(guī)模樣品篩選，是目前較常用的現(xiàn)場檢測手段；化學發(fā)光酶免疫分析方法，具有靈敏度高、特異性強、成本低、速度快、樣品前處理簡單和安全無污染等優(yōu)點，非常適合快速檢測；試紙條檢測方法簡便易行，但存在人為因素影響，易造成假陽性出現(xiàn)；GC－MS 和HPLC－MS－MS通常作為定量和確證方法，但操作復雜，且不能現(xiàn)場檢測，是目前實驗室常見的檢測方法。

現(xiàn)常用的鹽酸克倫特羅的檢測方法各有優(yōu)缺點，研究更快速、高效、檢測限更低、操作簡單、費用低廉的現(xiàn)場檢測方法是今后的發(fā)展方向。

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