沙棘葉水提物對(duì)小鼠非特異免疫功能的影響及抗凝血作用

屈長(zhǎng)青 丁計(jì)銀 王新魯 姬云濤 (阜陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 23604)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)為胡頹子科酸刺屬的落葉灌木、喬木或小喬木。別名黑刺、醋柳、酸刺。沙棘富含多種生物活性物質(zhì)，具有多種藥理功能〔1〕。沙棘黃酮是沙棘中一種重要的有效成分，沙棘葉和種子中總黃酮的含量高于果實(shí)，而且黃酮在降低血清膽固醇、抗腫瘤、抗?jié)儭⒖顾ダ?、抗輻射、抗炎、抗病毒、抗心肌缺血、抗心衰、抗心率失常等方面有明顯藥理功效〔2，3〕。沙棘黃酮在治療和緩解人類(lèi)的某些疾病，如高血糖、高脂血癥、心力衰竭及抑制血小板凝聚等方面具有明顯的作用〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究沙棘葉水提物對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能和抗凝血作用的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙棘葉，新疆清河縣隆豪發(fā)展有限公司提供;雞血(菜市場(chǎng)新鮮雞血);0.1%蛋白胨溶液;肝素鈉;白細(xì)胞稀釋液(冰醋酸1.5 ml、1%龍膽紫1 ml、加蒸餾水至100 ml);瑞氏染液;阿氏液(葡萄糖 2.05 g、枸櫞酸鈉0.8 g、檸檬酸0.055 g、氯化鈉0.42 g、加蒸餾水至100 ml，加熱溶解后將pH值調(diào)到6.1，經(jīng)69 kPa、15 min的高壓滅菌，放置在4℃的環(huán)境內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?

1.2 動(dòng)物及儀器 健康昆明種小白鼠8只，體質(zhì)量18～22 g，由胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。電子天平(上海精密科學(xué)有限公司);XMTD-8222烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);LEICA DM1000正置熒光顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉水提物的制備 取沙棘葉葉15 g，加入蒸餾水至600 ml，浸泡 1 h，煎煮 50 min，過(guò)濾，殘?jiān)偌铀?，煎?0 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮為500 mg/ml，4℃保存。用500 mg/ml沙棘葉水提物濃液配制成低、中、高劑量即10、20、30 mg/ml的溶液。

1.3.2 小鼠的分組和給藥 小鼠分4組每組6只，分別按高、中和低劑量灌胃，對(duì)照組給予生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。

1.3.3 斷尾法測(cè)量小鼠的出血時(shí)間 末次給藥1 h后，固定小鼠，在距離尾端1.5 mm處將其剪斷，待血液流出時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，并每隔30 s用吸水紙吸取血液一次，直至用吸水紙吸取時(shí)沒(méi)有血液為止，此段時(shí)間即為小鼠的出血時(shí)間。

1.3.4 玻片法測(cè)量小鼠凝血時(shí)間 末次給藥1 h后，在距離小鼠尾端5 mm處斷尾，在斷尾前盡可能地按摩小鼠尾部，從尾端到尾根，取干凈的玻片，分別在玻片的兩端滴一滴小鼠血液，自血液流出后開(kāi)始計(jì)時(shí)，隨后每隔30 s用針頭挑撥血液，至能夠挑出纖維狀蛋白時(shí)停下，此段時(shí)間即為小鼠的凝血時(shí)間〔7，8〕。

1.3.5 小鼠白細(xì)胞數(shù)的測(cè)量 末次給藥2 h后，在尾部取血20 μl，置于 380 μl的白細(xì)胞稀釋液中，混勻后計(jì)數(shù)。

1.3.6 脾指數(shù)和胸腺指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前稱(chēng)量小鼠體重，之后在做腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)的同時(shí)，剖取小鼠的脾和胸腺，用濾紙吸干殘血后，稱(chēng)鮮重，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.7 腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù) 實(shí)驗(yàn)前3 d，每天向小鼠腹腔注射1%的蛋白胨溶液，末次注射24 h后，再向小鼠腹腔注射1%的雞紅血細(xì)胞懸液1 ml，隨即輕輕按摩小鼠腹部，30 min后，頸椎脫臼處死小鼠，取其腹腔液做成涂片，稍干后，用瑞氏染液濃染2 min，加入等量蒸餾水淡染13 min，水洗后鏡檢觀察記錄。根據(jù)倒置顯微鏡觀察，按文獻(xiàn)〔9〕，計(jì)算吞噬百分率與吞噬指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 沙棘葉水提物對(duì)小鼠斷尾出血時(shí)間的影響 與對(duì)照組出血時(shí)間〔(2 640±268.328)s〕相比，不同劑量的沙棘葉水提物具有明顯的抗凝血作用，高劑量與中、低劑量差異顯著〔(52.30±177.482)、(4 512 ±269.665)、(4 308 ±79.145)s，P ＜0.01〕。

2.2 沙棘葉水提物對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 連續(xù)給藥10 d后，沙棘葉水提物能明顯延長(zhǎng)小鼠血液的凝血時(shí)間，高、中、低劑量組與對(duì)照組相比差異顯著〔(1 139.8±25.675)、(923.2±18.185)、(787.2 ±12.872)、(697.0 ±21.926)s，P ＜0.05〕。

2.3 沙棘葉水提物對(duì)小鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響 與對(duì)照組小鼠白細(xì)胞數(shù)量〔(555.4±299.078)個(gè)/ml〕相比，高、中、低劑量沙棘葉水提物組小鼠體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目明顯增多〔(7 869.0±173.940)、(10 045.0 ±880.057)、(6 012.6 ±205.946)個(gè)/ml，P＜0.05〕，中劑量組與高、低劑量組比較差異顯著。

2.4 沙棘葉水提物對(duì)小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 高、中劑量組小鼠脾指數(shù)明顯增高，中劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著增高(P ＜0.05，P ＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.5 沙棘葉水提物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組都能明顯提高小鼠的巨噬細(xì)胞功能，中劑量組與高、低劑量組差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表1 沙棘葉水提物對(duì)小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(s，n=6，mg/g)

表1 沙棘葉水提物對(duì)小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(s，n=6，mg/g)

與對(duì)照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，下表同

組別 脾指數(shù) 胸腺指數(shù)對(duì)照組2.304±0.030 5 2.964±0.093 2.204±0.028 2低劑量 3.052±0.087 2.300±0.031 6中劑量 3.390±0.0432) 2.520±0.033 91)高劑量 3.170±0.0372)

表2 沙棘葉水提物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響(s，n=6，%)

表2 沙棘葉水提物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響(s，n=6，%)

組別 吞噬率 吞噬指數(shù)對(duì)照組42.0±4.123 55.6±5.079低劑量 50.2±3.1151) 63.2±3.3471)中劑量 56.6±2.9662) 75.4±6.0952)高劑量 51.8±3.342) 65.2±4.1482)

3 討論

細(xì)胞免疫是機(jī)體抵抗細(xì)胞內(nèi)微生物(如病毒)和宿主細(xì)胞內(nèi)增生的細(xì)菌感染的防御機(jī)制。白細(xì)胞數(shù)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為判斷身體免疫功能強(qiáng)弱的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明，不同劑量的沙棘葉水提物和對(duì)照組比較能夠明顯增加白細(xì)胞的數(shù)目，中劑量效果顯著;同時(shí)也對(duì)小鼠脾臟和胸腺有明顯的增重效果，中劑量組脾、胸腺增重較多，指數(shù)較大。這與鐘飛等〔10〕給小鼠腹腔注射沙棘總黃酮，能明顯提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的結(jié)果一致。

腹腔巨噬細(xì)胞具有高度的吞噬能力，擔(dān)負(fù)機(jī)體非特異性免疫的防御機(jī)能，具有參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)被用作衡量機(jī)體免疫功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。韓春卉等〔11〕發(fā)現(xiàn)，沙棘油可明顯增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性、提高小鼠的單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。本實(shí)驗(yàn)證明不同劑量組的沙棘葉水提物也可增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)。在抗凝血方面，本實(shí)驗(yàn)也證明沙棘葉水提物有延長(zhǎng)小鼠的出血時(shí)間，抑制體內(nèi)外血栓的形成，可顯著降低小白鼠血小板黏附率，起到抗凝血的功效。

沙棘葉和種子中總黃酮的含量高于果實(shí)，黃酮在降低血清膽固醇、抗腫瘤、抗?jié)?、抗衰老、抗輻射、抗炎、等方面有明顯藥理功效。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了沙棘葉水提物對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能和抗凝血作用的影響，為沙棘葉的藥用價(jià)值和食用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其機(jī)制有待于深入研究。

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