單核細(xì)胞增生李斯特菌三種檢測(cè)方法的比較

張烜榕，顏軍，李文龍，侯敏，蔣玉佳，卜舒，李桂滿

（昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明650228）

單核細(xì)胞增生李斯特菌三種檢測(cè)方法的比較

張烜榕，顏軍，李文龍，侯敏，蔣玉佳，卜舒，李桂滿

（昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明650228）

目的：通過(guò)比較國(guó)標(biāo)法、real-time PCR法和LAMP方法，得到適合基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法。方法：分別用國(guó)標(biāo)法、real-time PCR法和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法檢測(cè)李斯特菌，并進(jìn)行方法比較。結(jié)果：三種方法對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)結(jié)果一致.國(guó)標(biāo)法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需5~7 d；real-time PCR法實(shí)驗(yàn)條件要求高，成本高，檢測(cè)需1.5~2.5 d；LAMP法實(shí)驗(yàn)條件低，成本低，檢測(cè)時(shí)限與real-time PCR相同。結(jié)論：LAMP法檢測(cè)單增李斯特菌靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效和低成本，適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)使用。

國(guó)標(biāo)法；LAMP；PCR；單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測(cè)

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一類兼性細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性桿菌，致病力較強(qiáng)，可引起人畜李斯特病，臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、單核細(xì)胞增多和胃腸炎，主要通過(guò)污染的肉類、乳制品和蔬菜等引起李斯特菌感染。國(guó)內(nèi)外對(duì)單增李斯特菌高度重視，1986年WHO已將其列為食品四大致病菌之一，2000年在WHO食品安全工作計(jì)劃中，已將該菌列為重點(diǎn)檢測(cè)的食源性致病菌之一〔1〕。最近，美國(guó)從2011年7月31日出現(xiàn)首例李斯特病病例報(bào)告至同年12月8日，共報(bào)告病例146例，死亡30例，這是10多年來(lái)美國(guó)最嚴(yán)重的一起食源性疾病暴發(fā)事件〔2〕。所以及時(shí)有效的控制食品中LM的污染是食品安全的重要保障之一。

LM的鑒定方法有國(guó)標(biāo)的分離鑒定法、免疫學(xué)鑒定法、PCR法等。分離培養(yǎng)鑒定法較簡(jiǎn)單，但操作繁瑣，鑒定過(guò)程需要5~7 d，檢出限較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿足突發(fā)事件的快速檢測(cè)要求。免疫學(xué)鑒定法由于菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)的存在，難以進(jìn)行李斯特菌種間的特異性鑒別〔3〕。PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和反應(yīng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，但需要昂貴的PCR儀，且檢測(cè)成本高，不適宜基層實(shí)驗(yàn)室使用。由Notomi等〔4〕在2000年設(shè)計(jì)的LAMP法是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，該方法是通過(guò)4條特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域和具有鏈置換活性的Bst（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶作用，在65℃的恒溫條件下擴(kuò)增。與PCR不同，LAMP不需要精密的PCR儀和昂貴的試劑〔5〕，尤其適合在缺乏設(shè)備支持的基層實(shí)驗(yàn)室和突發(fā)現(xiàn)場(chǎng)開(kāi)展檢測(cè)工作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)同時(shí)應(yīng)用國(guó)標(biāo)的分離鑒定法，PCR法和LAMP法檢測(cè)鑒定LM來(lái)比較LAMP方法在LM檢測(cè)中的高效性、準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 菌株實(shí)驗(yàn)室保存的李斯特菌11株。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備單增李斯特菌檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)自深圳易瑞生物技術(shù)有限公司；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法）購(gòu)自廣州華峰生物科技有限公司；瓊脂購(gòu)自基因公司；10000×SYBR GreenI購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；全自動(dòng)微生物生化鑒定儀（VITEK32）；上海一恒恒溫水浴鍋；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)；北京八一六廠電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 國(guó)標(biāo)法根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》GB4789.30-2010分離鑒定菌株。李氏增菌肉湯LB1 30℃培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)種李氏增菌肉湯LB2 30℃培養(yǎng)24 h，接種于PALCAM平板和李斯特氏顯色培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)24 h，取菌落分別接種在木糖和鼠李糖發(fā)酵管36℃培養(yǎng)24 h，同時(shí)在TSA-YE上純化30℃培養(yǎng)24 h，選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的菌繼續(xù)進(jìn)行全自動(dòng)生化鑒定6~7 h，并依次進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)、生化鑒定和溶血試驗(yàn)。

1.3.2 real-time PCR法取培養(yǎng)24 h的LB2增菌液1 mL，10 000 r/min離心2 min，棄上清，加入80 μL DNA提取液混勻煮沸裂解10 min，置冰上10 min，10 000 r/min離心2 min，上清即為模板。按試劑盒說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備反應(yīng)體系，分別取5 μL陰性、陽(yáng)性質(zhì)控品和提取的DNA加入反應(yīng)體系中。循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃10 min，1次循環(huán)；變性95℃10 s，退火、延伸及檢測(cè)熒光58℃45 s，40次循環(huán)。

1.3.3 LAMP法菌株DNA提取參見(jiàn)real-time PCR法。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別取2.5 μL陰性、陽(yáng)性質(zhì)控品和提取的DNA加入反應(yīng)體系中，置65℃60 min。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 國(guó)標(biāo)法VITEK32直接判讀結(jié)果后，進(jìn)行后續(xù)的生化試驗(yàn)鑒定。所用李斯特菌株生化反應(yīng)特征，見(jiàn)表1。

表1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特征與其他李斯特氏菌的區(qū)別

1.4.2 real-time PCR法陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線。Ct值≥38或undet為陰性結(jié)果，Ct值＜35為陽(yáng)性結(jié)果，35≤Ct值＜38為檢測(cè)灰區(qū)，重復(fù)測(cè)定兩次，兩次測(cè)定Ct值≥38為陰性結(jié)果，其中一次Ct值＜38為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.3 LAMP法肉眼觀察產(chǎn)物顏色變化，出現(xiàn)綠色判定為陽(yáng)性，橙色為陰性。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，有不同大小的梯形條帶為陽(yáng)性結(jié)果，不產(chǎn)生條帶為陰性結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 國(guó)標(biāo)法檢測(cè)11株李斯特菌中7株為L(zhǎng)M，3株為英諾克李斯特菌，1株為伊氏李斯特氏菌，見(jiàn)表2。11株李斯特菌4株從速凍熟制米面制品中分離，3株從熟肉制品中分離，2株從即食非發(fā)酵性豆制品中分離，1株為省疾控下發(fā)質(zhì)控，1株為國(guó)家臨檢中心下發(fā)考核樣。其中，檢出7株LM中除1株為省疾控下發(fā)質(zhì)控樣外，其余為2株從速凍熟制米面制品中分離，2株從熟肉制品中分離，2株從即食非發(fā)酵性豆制品中分離；3株英諾克李斯特菌中1株從熟肉制品中分離，2株從速凍熟制米面制品中分離；1株伊氏李斯特菌是國(guó)家臨檢中心下發(fā)考核樣，見(jiàn)表2。說(shuō)明李斯特菌對(duì)環(huán)境要求和營(yíng)養(yǎng)要求都不高，可污染不同的食物，特別是加工后即食的食品。

2.2 real-time PCR法采用針對(duì)目標(biāo)菌為L(zhǎng)M的熒光PCR法分別對(duì)11株實(shí)驗(yàn)菌株核酸進(jìn)行擴(kuò)增，其中有7株菌株P(guān)CR擴(kuò)增呈現(xiàn)典型S型擴(kuò)增曲線，Ct值均＜35，檢測(cè)結(jié)果為L(zhǎng)M，其它4株李斯特菌為陰性，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法一致，見(jiàn)表3。

表2 國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果

表3 三種方法檢測(cè)單增李斯特菌結(jié)果比較

2.3 LAMP法恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)驗(yàn)菌株核酸，目測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，11株李斯特菌中有7株綠色為L(zhǎng)M，其余橙色為其它李斯特菌，結(jié)果見(jiàn)圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，7株LM菌株與陽(yáng)性質(zhì)控菌株一樣有相同的明亮的梯形條帶，4株非單增李斯特菌沒(méi)有典型的LAMP擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖2。其LM檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法和real-time PCR法檢測(cè)一致，見(jiàn)表3。

圖1 LAMP法檢測(cè)單增李斯特菌目測(cè)結(jié)果

圖2 LAMP法檢測(cè)單增李斯特菌瓊脂糖電泳圖

3 討論

LM廣泛存在于自然界中，生存條件要求不高，在極端環(huán)境中仍可生長(zhǎng)。該菌在5~45℃均可生長(zhǎng)，經(jīng)58~59℃10 min可殺死，在5℃低溫生長(zhǎng)是典型特征之一，在-20℃可存活一年，能在冰箱冷藏室內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖，不易被凍融，耐堿不耐酸，在pH 9.6中仍能生長(zhǎng)，在10%NaCl中可生長(zhǎng)，在4℃的20%NaCl中仍可存活8周。該菌引起致病的物質(zhì)為李斯特菌溶素O，此溶素須細(xì)菌被吞噬后在細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)釋放。幾乎所有被診斷為單增李斯特菌感染的患者均有侵襲性感染癥狀（即細(xì)菌從胃腸道擴(kuò)散到血液或其他部分），突出的臨床表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎、腦脊髓炎、發(fā)熱，有時(shí)可引起心內(nèi)膜炎。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生活節(jié)奏越來(lái)越快，人們對(duì)即食食品、冷藏和速凍食品的需求量迅速增加，這也同時(shí)增加了LM對(duì)人們的威脅，因此對(duì)LM進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)能有效的保證食品安全衛(wèi)生。本實(shí)驗(yàn)選取的11株李斯特菌有分離于速凍熟制米面制品、熟肉制品和即食非發(fā)酵性豆制品，說(shuō)明LM在我們周圍是普遍存在的，其生存條件要求不高，生存耐受力很強(qiáng)，在冰箱冷藏室內(nèi)仍可生長(zhǎng)繁殖的生存能力使其具有極高的感染人畜的潛在危險(xiǎn)機(jī)率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用三種方法對(duì)LM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，獲得一種較為簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法。國(guó)標(biāo)法是對(duì)分離培養(yǎng)后的可疑菌落通過(guò)生化試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，檢驗(yàn)過(guò)程需要5~7 d，耗時(shí)耗力、且操作復(fù)雜，不能達(dá)到迅速為食物中毒等食品安全突發(fā)事件提供病原學(xué)依據(jù)的要求。Real-time PCR法特異性強(qiáng)、靈敏度高，省時(shí)省力，其檢驗(yàn)過(guò)程需要1.5~2.5 d，但需要昂貴的PCR儀，而且對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求和操作人員技術(shù)的要求都很高，在一定程度上限制了其發(fā)展和應(yīng)用。近年來(lái)的研究〔6-9〕表明LAMP法在檢測(cè)各種食源性致病菌方面具有很多優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LAMP法檢測(cè)了11株李斯特菌株，結(jié)果對(duì)其中7株LM的核酸均有擴(kuò)增，對(duì)其余4株其它李斯特菌的核酸均無(wú)擴(kuò)增，其結(jié)果與國(guó)標(biāo)法和realtime PCR法一致，檢驗(yàn)過(guò)程需1.5~2.5 d，顯示出該方法對(duì)LM的檢測(cè)的特異性、靈敏性和準(zhǔn)確性不亞于PCR法，且對(duì)試劑要求簡(jiǎn)單，儀器要求不高，只需要提供恒定溫度的設(shè)備即可，產(chǎn)物鑒定簡(jiǎn)便易行，視覺(jué)觀察產(chǎn)物變綠的是LM，橙色是非單增李斯特菌，因而能在短時(shí)間內(nèi)、簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)條件和要求不高的實(shí)驗(yàn)環(huán)境下為食品安全突發(fā)事件提供快速的病原學(xué)的初步檢測(cè)依據(jù)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)三種檢測(cè)鑒定方法的結(jié)果比較可知LAMP法檢測(cè)LM是三種檢測(cè)法中較簡(jiǎn)便和快速的方法，與其它核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、成本低、對(duì)設(shè)備條件要求低等方面的優(yōu)勢(shì)。其特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速高效和產(chǎn)物鑒定簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適合縣區(qū)級(jí)疾病預(yù)防控制中心快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)等應(yīng)用。

〔1〕嚴(yán)劍波，王虹玲，朱水榮，等.單增李斯特菌LMAP方法的建立〔J〕.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（9）：2048-2050.

〔2〕Multistate Outbreak of Listeriosis Linked to Whole Cantaloupes from Jensen Farms，Colorado〔EB/OL〕.〔2011-11-08〕.http：//www.cdc.gov/listeria/outbreaks/ cantaloupes-jensen-farms/index.html.

〔3〕巢國(guó)祥，周曉輝，焦新安.單核細(xì)胞增生性李斯特菌PCR快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用〔J〕.中國(guó)人獸共患病雜志，2004，20（9）：797-800.

〔4〕Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA〔J〕.Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.

〔5〕肖斌，朱永紅，鄒全明.簡(jiǎn)便敏感的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因診斷新技術(shù)〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（7）：761-763.

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〔7〕Song T，Toma C，Nakasone N，et al.Sensitive and rapid detection of Shigella and enteroin vasive Escherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method〔J〕. FEMS Micribiol Lett，2005，243（1）：259-263.

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〔9〕侯敏，顏軍，張烜榕，等.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)志賀氏菌的研究〔J〕.云南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，17（2）：28-31.

（責(zé)任編輯 李楊）

Comparison of Three Methods of Listeria monocytogenes Detection

ZHANG Xuanrong,YAN Jun,LI Wenlong,HOU Min,JIANG Yujia,BU Shu,LI Guiman
（Disease Control and Prevention Center of Kunming,Kunming 650228,China）

Objective:To find a suitable method for rapid detection of Listeria monocytogenes（LM）in grassroots labs.Methods: GB law,real-time PCR and LAMP were adopted to detect LM,then,the results were evaluated.Results:The results of the three mothods were quite consistent.The detection process of GB law took 5 to 7 days.While the real-time PCR requiring high experimental conditions and cost took 2.5 days.LAMP method,requiring low experimental conditions and cost,took the same time as the real-time PCR.Conclusion:The LAMP assay was a sensitive,specific,rapid and economical method for the detection of LM, which could be widely used by grassroots labs.

GB law;LAMP;PCR;detection of Listeria monocytogenes

R155.5

A

1672-2345（2013）06-0038-05

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.011

2012-09-16

2012-10-16

張烜榕，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事病原生物檢驗(yàn)研究.