黑乳海參硫酸化多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)特征及其抗凝活性

盧鋒，吳明一，高娜，劉光明，趙金華*

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理671000；2.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明650201）

黑乳海參硫酸化多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)特征及其抗凝活性

盧鋒1，2，吳明一2，高娜2，劉光明1，趙金華2*

（1.大理學院藥學與化學學院，云南大理671000；2.中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明650201）

目的：研究黑乳海參（Holothuria nobilis Selenka）中硫酸化多糖類型、理化性質(zhì)及抗凝活性。方法：利用化學和物理相結(jié)合的分離方法進行純化，采用色譜、化學、光譜等方法對其純度、化學組成、分子量、特性黏度、旋光度、凝血活性等進行分析。結(jié)果：分離獲得F-I、F-II兩種多糖組分。F-I由葡萄糖醛酸、乙酰氨基半乳糖、巖藻糖和硫酸基（摩爾比1.00∶0.96∶1.18∶2.99）組成；F-II僅由巖藻糖和硫酸基（摩爾比1.00∶0.51）；它們的理化性質(zhì)顯著不同，前者的抗凝效價約為后者的6倍。結(jié)論：黑乳海參中至少存在兩種不同的硫酸化多糖，巖藻糖化糖胺聚糖和α-L-硫酸化巖藻聚糖，均具有強的抗凝血活性。

海參；多糖；純化；理化性質(zhì)；抗凝活性

近二十多年來，海參來源的硫酸化多糖的研究受到廣泛關注。已報道的海參來源的硫酸化多糖的化學結(jié)構(gòu)獨特，其與哺乳動物來源的酸性黏多糖（糖胺聚糖）、陸生植物來源的酸性雜聚糖以及海洋來源的硫酸化巖藻聚糖均存在顯著差異。研究表明，海參來源的硫酸化多糖可具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗心血管疾病、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等〔1〕。黑乳海參（Holothuria nobilis Selenka）屬棘皮動門（Echinodermata）海參綱（Holothuroidea）楯手目（Aspidochirotida）海參科（Holothuriidae）動物，在我國福建東山及西沙群島海域均有分布，在東非等海域也有分布〔2〕，資源相對豐富。目前，研究表明〔3〕，黑乳海參含有多種皂苷類化學成分，但體壁多糖類組分則報道較少。本文研究黑乳海參體壁中硫酸化多糖組分，分離純化了兩種硫酸化多糖組分F-I和FII，其中，對F-I和F-II的化學組成、理化性質(zhì)進行初步研究，確認F-I為雜聚糖，其化學結(jié)構(gòu)鑒定為巖藻糖化糖胺聚糖（fucosylated glycosaminoglycan，F(xiàn)GAG），而F-II為均聚糖，其化學結(jié)構(gòu)為硫酸化巖藻聚糖（fucan sulfate，F(xiàn)S）。

1 材料

1.1 實驗材料木瓜蛋白酶（規(guī)格：1 kg/瓶，批號SLBB9515V），巖藻糖標準品（批號060M1320），氨基半乳糖標準品（批號030M1865）廠家均為美國Sigma；葡萄糖醛酸標準品（批號10136713），半乳糖標準品（批號10134490），葡萄糖標準品（批號10145311）廠家均為美國AlfaAesar；右旋糖酐系列標準品（批號140637-2000-01至140646-2000-01），購自中國藥品生物制品檢定所。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器FE20 pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；FD-5冷凍干燥機（北京博醫(yī)康公司）；BSZ-100自動部分收集器（上?？等A生化公司）；3.5 kDa透析袋（上海歐韋達儀器科技有限公司）；1836A烏氏黏度計（上海良晶玻璃儀器廠）；DDSJ-308A雷磁電導率儀（上海精科公司）；p-1-020全自動數(shù)字旋光儀（日本Jasco）；Bruker Tensor27型紅外光譜儀；AvanceIII 600 MHz超導核磁共振儀（瑞士布魯克公司）；Dowex（r）50WX8 50-100目（1×13 cm）強酸型陽離子交換樹脂（美國Alfa Aesar）；DE 52（3×10 cm）陰離子交換樹脂（北京經(jīng)科宏達生物公司）。

1.3 實驗動物市售黑乳海參的干燥體壁，經(jīng)中國科學院青島海洋研究所肖寧博士鑒定為黑乳海參（Holothuria nobilis Selenka）。

2 實驗方法

2.1 黑乳海參多糖的提取純化干燥黑乳海參310 g，10倍去離子水浸泡過夜后搗碎，0.5 mol/L NaOH中60℃下堿解2 h，冷卻后，6 mol/L HCl調(diào)pH中性后，以5%木瓜蛋白酶50℃下酶解6 h，90℃滅酶冷卻后，等電點法（pH 2.8，4℃）除蛋白。提取液醇沉淀（60%乙醇，4℃），沉淀經(jīng)無水乙醇洗滌后，真空干燥得粗多糖（約19.5 g）。粗多糖20倍量水溶，H2O2氧化法脫色（3%H2O2，pH 11，50℃），冷卻后將pH調(diào)至7，離心去沉淀，上清液在4℃下以終濃度40%和60%乙醇分級醇沉。

40%醇沉產(chǎn)物水溶后，繼以2 mol/L醋酸鉀鹽析，透析（3.5 kDa透析袋）所得沉淀，凍干得多糖組分FI（1.26 g）。60%醇沉產(chǎn)物水溶后，過DE 52（3×10 cm）陰離子交換樹脂柱，含0.05 mol/L醋酸鉀的0.50~2.00 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，自動部分收集器收集的各流份經(jīng)高效凝膠色譜（HPGPC）法檢測。HPGPC保留時間相同的流份合并后，3.5 kDa的透析袋透析，凍干，得多糖組分F-II（1.88 g）。

2.2 分子量及其分布的測定HPGPC法分析F-I、F-II的分子量及其分布〔4〕。Agilent 1200型高效液相色譜儀，Shodex Ohpak SB-804 HQ（7.8 mm×300 mm）凝膠色譜柱，柱溫35℃，G1362A示差檢測器檢測，流動相為0.1 mol/L NaCl，流速0.5 mL/min。以系列分子量右旋糖酐作分子量工作曲線，再以已知分子量（6.582 kDa）的FGAG校正上述曲線。樣品、標準品溶液進樣量均為25 μL，根據(jù)HPGPC色譜圖，繪制多糖分子量-洗脫體積標準曲線。根據(jù)標準曲線，GPC專用軟件計算F-I、F-II的分子量及其分布。

2.3 理化性質(zhì)檢測

2.3.1 比旋光度測定精確稱取F-I、F-II各5.00 mg，溶于1 mL H2O，按中國藥典（2010版）二部附錄VIE方法測定。

2.3.2 特性黏數(shù)的測定精確稱取F-I、F-II各40.0 mg溶于4 mL 0.1 mol/L NaCl，按照中國藥典（2010版）二部附錄VIG方法，應用烏式黏度計測定。

2.4 化學組成檢測

2.4.1 柱前衍生化法檢測單糖組成取F-I、F-II 5.00 mg，加2 mol/L三氟乙酸1 mL 100℃水解8 h，水解液蒸干，加1 mL水溶解，取水解液與0.6 mol/L NaOH，混勻；加0.5 mol/L PMP進行衍生化30 min，取出冷至室溫，HCl中和；加水溶解，等體積氯仿萃取，棄去氯仿相，將水相過濾后與混合單糖對照品利用高效液相色譜法（HPLC）進行分析。

2.4.2 葡萄糖醛酸的測定將多糖組分F-I、F-II配成1 mg/mL的水溶液，以葡萄糖醛酸為標準品，利用間羥鄰苯法進行測定〔5〕。

2.4.3 氨基半乳糖的測定將F-I、F-II經(jīng)酸水解后，以乙酰氨基半乳糖為標準品，利用Elson-morgan法進行測定〔5〕。

2.4.4 巖藻糖的測定將F-I、F-II配成1 mg/mL的水溶液，以巖藻糖為標準品，利用半胱氨酸法進行測定〔8〕。

2.4.5 硫酸羧酸摩爾比的測定準確稱取樣品5 mg，經(jīng)Dowex（r）50WX8 50-100目（1×13 cm）強酸型陽離子交換樹脂轉(zhuǎn)化成氫型，用0.01 mol/L的NaOH滴定液在電導率儀監(jiān)測下滴定，通過滴定曲線計算〔5〕。

2.5 紅外光譜KBr壓片法，Bruker Tensor27型紅外光譜儀掃描樣品在4000~400 cm-1的紅外光譜。

2.61H NMR譜圖稱取樣品5 mg，溶于500 μL D2O（99.9 Atom%D）中，于25℃600 MHz超導核磁共振儀下測定。

2.7 抗凝活性參照文獻〔6〕檢測活化部分凝血活酶時間（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）、凝血酶原時間（Prothrombin Time，PT）、凝血酶時間（Thrombin Time，TT）。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑乳海參多糖的提取與純化本文采用堿解-酶解法提取黑乳海參體壁多糖，其粗多糖得率約6.29%。海參所含糖胺聚糖類成分FGAG以糖蛋白形式存在于體壁，堿解的目的是通過去垢消解組織結(jié)構(gòu)，也是裂解FGAG連接核心蛋白的糖苷鍵；酶解的作用是水解蛋白，促進多糖釋放以及利于后續(xù)純化。

黑乳海參粗多糖的HPGPC圖譜（圖1中A）可見a、b、c等主要色譜峰，其中，根據(jù)二極管整列檢測器獲得的c峰UV光譜信息判斷，其主要組成成分是蛋白解聚過程產(chǎn)生的寡肽類物質(zhì)，并非糖類化合物。

所得粗多糖首先通過分級醇沉初步分離a、b兩個色譜峰對應的多糖組分，繼而通過鹽析、透析等純化步驟獲得與色譜峰b（圖1中B）對應的多糖組分FI，通過離子交換色譜層析以及透析純化等步驟獲得與色譜峰a（圖1中C）對應的多糖組分處理獲得F-II。所得多糖組分F-I、F-II的得率分別為0.41%和0.61%。

檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)-I、F-II的HPGPC色譜峰的峰形對稱，結(jié)合后文所述理化性質(zhì)檢測可以判斷，F(xiàn)-I、F-II均為均一性多糖。

3.2 F-I與F-II的基礎理化性質(zhì)

3.2.1 分子量及分布HPGPC檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)-I、F-II多糖組分的重均分子量分別為約55，320 Da和約475，800 Da，體現(xiàn)分子量分布特征的分散系數(shù)（Mw/Mn）分別為約1.3和1.6，表明兩種多糖成分均具有良好的均一性。見圖1和表1。

圖1 黑乳海參粗多糖及其純化組分的HPGPC色譜圖

3.2.2 旋光度與特性黏度如表1所示，F(xiàn)-I、F-II的比旋度分別為約-46°和約-193°，其數(shù)值分別接近文獻報道的巖藻糖化糖胺聚糖〔7〕以及巖藻聚糖〔8〕，并且提示，F(xiàn)-I、F-II多糖組分中均可能存在α-L-巖藻糖殘基。F-I、F-II的特性黏數(shù)分別為約34和約428 mL/g，顯然，其黏度與多糖組分的分子量大小相關，同時也與硫酸酯多糖的屬性相關。

表1 多糖組分F-I與F-II的理化特征

3.2.3 單糖組成柱前衍生化單糖組成分析結(jié)果，見圖2。F-I的組成單糖包括葡糖糖醛酸（GlcUA）、乙酰氨基半乳糖（GalNAc）和巖藻糖（Fuc），而F-I的組成單糖僅巖藻糖（Fuc）。見表2。F-I、F-II均含有一定量的硫酸基團。電位滴定法檢測的F-I多糖組分中的羧酸基和硫酸基的摩爾比為1∶2.99。顯然，F(xiàn)-I、F-II均為硫酸化多糖。F-II是由硫酸化L-巖藻糖組成的大分子均聚糖，硫酸化巖藻聚糖（FS）。F-I由三種單糖組成，其中，GlcUA和GalNAc兩種單糖的組成比例接近1∶1，提示其可能存在類糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的多糖主鏈。

3.3 波譜分析

圖2 柱前衍生化法分析單糖組成的HPLC圖譜

表2 多糖組分F-I與F-II的化學組成

圖3 F-1、F-II紅外吸收光譜

3.3.1 IR光譜F-I、F-II的紅外光譜，見圖3。其中，F(xiàn)-I IR譜圖顯示了較典型的巖藻糖化糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)特征〔9〕。1 254 cm-1為S=O非對稱伸縮振動〔10〕，顯示硫酸酯基的存在；1 645 cm-1的C=O伸縮振動峰以及1 428 cm-1的羧基C-O伸縮振動，提示GlcUA羧基及GalNAc乙?；拇嬖冢?53和822 cm-1譜峰提示FI中GalNAc可存在4-、6-位硫酸酯基取代。F-I、F-II中3 347和3 348 cm-1處的寬峰為醇羥基O-H和N-H伸縮振動峰，1 130-1 170 cm-1范圍內(nèi)的譜峰顯示了糖環(huán)內(nèi)C-O-C伸縮振動；1 051-1 052 cm-1顯示糖環(huán)仲醇C-O伸縮振動。此外，F(xiàn)-II譜圖中和1 257 cm-1為S=O譜峰，1 647 cm-1為結(jié)晶水吸收峰〔11〕。

3.3.21H NMR譜圖F-I1H NMR譜圖。見圖4中A。Fuc甲基峰出現(xiàn)在約1.29~1.35 ppm處，GalNAc甲基峰位于約2.04~2.06 ppm，兩甲基峰的面積比約1∶1.15，此與單糖組成的化學法分析結(jié)果基本一致。FII1H NMR譜圖中可見約1.28 ppm處的Fuc甲基峰，未見GalNAc甲基峰，與F-II不含GalNAc相符。

圖4 F-I和F-II的1H NMR譜圖

F-I和F-II譜圖中均可見位于5.1~5.7 ppm處信號峰，其為α-L-Fuc的異頭碳質(zhì)子信號〔6，12〕，其信號峰面積與Fuc甲基峰面積比約1∶3。F-I為巖藻糖化糖胺聚糖（FGAG），其α-L-巖藻糖的異頭碳質(zhì)子信號的位置與其硫酸酯的存在位置相關，黑乳海參FGAG中的Fuc的端基氫信號均位于5.35~5.48 ppm之間，與見于報道的梅花參、刺參以及L.grisea〔6，13-14〕來源的FGAG相比，基本不含端基信號位于約5.6 ppm的2，4-二硫酸巖藻糖基。F-II所含F(xiàn)uc端基氫信號主要分為兩組，其分別位于5.1~5.15 ppm和5.4~ 5.5 ppm處，且兩組信號峰的面積比接近1∶1，其與提示其可能存在規(guī)則的單糖連接順序。F-I和F-II譜圖中的糖環(huán)氫信號復雜，重疊嚴重，尚難精確歸屬，但其基本特征分別與FGAG和FS硫酸化多糖的結(jié)構(gòu)特征相符。

3.4 抗凝活性F-I、F-II對人血漿APTT、PT、TT時間的影響，見表3。結(jié)果表明，F(xiàn)-I和F-II均具有一定的抗凝血活性，且F-I對APTT的影響大于F-II，但二者均小于肝素，同時F-I、F-II對PT及TT幾乎無影響。表中數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)-I、F-II均有一定的抗內(nèi)源性凝血活性，且F-I比F-II較強。

表3 多糖組分F-I與F-II的抗凝活性

4 討論

本文從黑乳海參干燥體壁中分離純化得到了兩種硫酸化的多糖F-I和F-II，并初步表征了它們的理化性質(zhì)。

單糖組成、IR和1H NMR分析結(jié)果顯示，F(xiàn)-I為巖藻糖化糖胺聚糖（FGAG），1H NMR譜圖分析表明，與已見報道的刺參、梅花參以及L.grisea來源的FGAG相比，其基本化學結(jié)構(gòu)存在近似之處，但側(cè)鏈巖藻糖基類型存在顯著不同；F-II為硫酸化巖藻聚糖，其1H NMR顯示其可能具有規(guī)則的連接次序。F-I和F-II均具有一定的抗凝活性，其中，以APTT時間影響計，F(xiàn)I的活性較F-II強約6倍。

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（責任編輯 李楊）

Extraction,Purification,Structure Characteristics and Anticoagulation of the Sulfated Polysaccharides from the Sea Cucumber Holothuria nobilis

LU Feng1,2,WU Mingyi2,GAO Na2,LIU Guangming1,ZHAO Jinhua2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China,Kunming Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650201,China）

Objective:To study the polysaccharide types,physicochemical properties and anticoagulant activities of sulfated polysaccharides from the sea cucumber Holothuria nobilis Selenka.Methods:Sulfated polysaccharides were purified by methods of chemistry and physics.Physicochemical properties and biological activities of the saccharides,such as purity,chemical composition, molecular weight,intrinsic viscosity,optical rotation and anticoagulant activities were determined by methods of chromatography, chemistry,spectrum technologies,etc.Results:The polysaccharides were separated into two fractions,F-I and F-II,respectively.The components of F-I were identified as glucuronic acid,aminogalactose,fucan and sulfate（molar ratio 1.00∶0.96∶1.18∶2.99）;F-II contained only fucan and sulfate（molar ratio 1.00∶0.51）.The two polysaccharides were significantly different in the physicochemical properties,and F-I had 6 times of anticoagulant potency compared to the F-II.Conclusion:The sea cucumber H.nobilis contains at least two types of sulfated polysaccharides,a fucosylated glycosaminoglycan sulfate and a sulfated α-L-fucan which have anticoagulant activities.

sea cucumber;polysaccharides;purification;physico chemical characteristics;anticoagulant activities

R284.1

A

1672-2345（2013）06-0012-05

10.3969/j.issn.1672-2345.2013.06.004

云南省高端人才引進計劃基金資助項目（2010CI116）；國家自然基金青年科學基金資助項目（81102372）

2013-03-18

2013-04-06

盧鋒，碩士研究生，主要從事天然藥物化學研究. *通信作者：趙金華，研究員.