不同溫度大鼠無血預(yù)充深低溫停循環(huán)模型的建立

朱 賢，陸 龍，趙向東，孫燕華，吳樹彬，劉晉萍，吉冰洋，姚建民

·基礎(chǔ)研究·

不同溫度大鼠無血預(yù)充深低溫停循環(huán)模型的建立

朱 賢，陸 龍，趙向東，孫燕華，吳樹彬，劉晉萍，吉冰洋，姚建民

目的建立溫度可控的大鼠深低溫停循環(huán)（DHCA）完全腦缺血模型。方法23只SD大鼠分為五組。A組：DHCA 15～20℃（n＝5）；B組：DHCA 20～25℃（n＝5）；C組：DHCA 25～30℃（n＝5）；D組：常溫體外循環(huán)組（n＝5）；E組：假手術(shù)組（n＝3）。七氟烷誘導(dǎo)麻醉，頸靜脈置入自制多孔靜脈引流管為靜脈引流端，左側(cè)股動脈22G套管針穿刺監(jiān)測血壓，鼠尾動脈20G套管針穿刺為動脈灌注端，轉(zhuǎn)機(jī)過程中分別于6個時間點抽取血氣，記錄各時間點血氣值及復(fù)跳時間。結(jié)果2只大鼠死亡，其余21只大鼠均順利完成實驗過程，DHCA各組心臟復(fù)跳后，乳酸值明顯升高，血壓、心率較D、E組降低。結(jié)論本實驗?zāi)Ｐ涂捎糜谘芯繙囟燃捌渌深A(yù)條件下DHCA對大腦及其他臟器的影響。

深低溫停循環(huán)；大鼠；模型

深低溫停循環(huán)（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）技術(shù)的應(yīng)用已有60多年的歷史，目前常用于成人大血管外科以及部分小兒復(fù)雜先天性心臟病的畸形矯治，在臨床上發(fā)揮著重要作用，然而，DHCA技術(shù)引起諸多并發(fā)癥，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，長久以來困擾著臨床工作者。

目前，針對深低溫停循環(huán)DHCA的實驗研究，仍然缺乏一個有效的動物模型。傳統(tǒng)的大動物模型費用昂貴，需要耗費較大的人力物力，不適合大樣本實驗的開展。大鼠價格便宜，來源豐富，和人類同源性較好且具有豐富的基因和蛋白的檢測手段，受到廣大臨床科研工作者的青睞［1］。本篇文章結(jié)合近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究，建立了一種改良的大鼠深低溫停循環(huán)DHCA模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 本實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。成年健康雄性SD大鼠23只，體重350～450 g（由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院動物中心提供），根據(jù)停循環(huán)溫度的不同分為五組：A組：DHCA 15～20℃（n＝5）；B組：DHCA 20～25℃（n＝5）：C組：DHCA 25～30℃（n＝5）；D組：常溫體外循環(huán)組（n＝5）；E組：假手術(shù)組（n＝3）。

1.2 體外循環(huán)管道［2］整體管道由回流室（5 ml注射器），硅膠管道（內(nèi)徑4 mm），小動物膜肺（東莞科威醫(yī)療用品有限公司，預(yù)充量＜4 ml），變溫器（西京醫(yī)療用品有限公司，預(yù)充量＜3 ml），雙頭滾壓泵（德國Stockert公司），變溫水箱（Maquet Critical Care AB，Solna，Sweden）。管道預(yù)充液組成：11 ml膠體（6%羥乙基淀粉130/0.4，北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司），0.5 ml肝素（250 IU/ml，常州千紅生化制藥有限公司），維持回流室2～3 ml初始液面高度。

1.3 外科準(zhǔn)備 隨機(jī)選取實驗大鼠，稱重。七氟烷吸入誘導(dǎo)麻醉，四肢固定于操作臺，置肛溫。16G麻醉套管針經(jīng)口氣管內(nèi)插管，接小動物呼吸機(jī)（Harvard Apparatus）行機(jī)械通氣，吸入100%純氧混合3%七氟烷維持麻醉，呼吸頻率初始設(shè)定為60次/min，潮氣量8～10 ml/kg（可根據(jù)血氣值進(jìn)行調(diào)節(jié)）。在外科顯微鏡（Oberkochen German）下進(jìn)行尾動脈（20G套管針灌注用）、左側(cè)股動脈（22G套管針監(jiān)測用）穿刺置管，右側(cè)頸靜脈（22G靜脈輸液針硅膠管改制）用精細(xì)外科剪刀剪開，在動脈鞘管導(dǎo)絲引導(dǎo)下，經(jīng)缺口送入靜脈引流管，尖端至右房水平（前期實驗中已明確頸靜脈至右心房距離并做上標(biāo)記）。所有置管血管遠(yuǎn)心端絲線結(jié)扎，近心端絲線固定置管，防止滑脫。靜脈引流重力高度為35 cm。全身400 U/kg肝素化后，行持續(xù)血流動力學(xué)監(jiān)測。

1.4 轉(zhuǎn)流過程 體外循環(huán)管道預(yù)充排氣，預(yù)充液為6%羥乙基淀粉130/0.4。所有靶血管置管完畢后，將靜脈引流管置于回流室，開始體外循環(huán)，根據(jù)引流速度調(diào)整合適泵速，維持回流室液面平衡，以純氧和二氧化碳混合氣體進(jìn)行氧合并根據(jù)實際血氣值進(jìn)行調(diào)節(jié)，盡可能維持pH值和二氧化碳分壓（PCO2）的相對穩(wěn)定。實驗過程中若出現(xiàn)血壓明顯下降，則予以補充膠體，所有實驗過程均不使用任何血管活性藥物。轉(zhuǎn)中動脈灌注流量為100～150 ml/（kg·min）。

轉(zhuǎn)流過程分為五個階段：①常溫體外循環(huán)：維持15 min；②降溫：利用變溫水箱降至目標(biāo)溫度，時間限定為30 min；③停循環(huán)：降溫完畢后停機(jī)，靜脈端繼續(xù)引流，取20 ml注射器自回流室吸取大鼠血液儲存，直至血壓成一條直線時夾閉靜脈端，停循環(huán)維持30 min，期間出現(xiàn)溫度上升時，給予體表均勻碎冰屑維持溫度；④復(fù)溫：將20 ml注射器中的血液重新注入回流室，靜脈引流打開，開始體外循環(huán)，變溫水箱復(fù)溫，溫差＜8℃，心臟復(fù)跳，直至溫度達(dá)到33～34℃以上，復(fù)溫時間為1 h；⑤停機(jī)：體溫達(dá)到目標(biāo)溫度后停機(jī)，呼吸機(jī)維持30 min。

1.5 實驗數(shù)據(jù)采集 分別于術(shù)前，降溫前，停循環(huán)前，復(fù)溫后20 min，停機(jī)前，停機(jī)后30 min六個時間點采集大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)和進(jìn)行血氣分析。

1.6 統(tǒng)計處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）表示，對六個時間點數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)之間應(yīng)用LSD檢驗（Least significant Difference，最小顯著差值法）；P＜0.05表明有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 實驗結(jié)果 各組大鼠體重均值無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗過程中共出現(xiàn)2只大鼠死亡，C組中1只大鼠復(fù)跳后出現(xiàn)無法控制的低血壓后停止實驗，開腹檢查后發(fā)現(xiàn)不明原因的腹腔出血。D組中1只大鼠在轉(zhuǎn)機(jī)開始10 min后突然出現(xiàn)血壓下降，補充液體無明顯效果后停止實驗，開腹檢查發(fā)現(xiàn)腹腔間隙滲液較多，考慮是由過敏反應(yīng)引起的急性血壓下降。其余21只大鼠均順利停機(jī)。實驗結(jié)束后開腹檢查，A、B、C、D四組腹腔中均發(fā)現(xiàn)有不同程度的間隙滲出，D組滲出程度輕于A、B、C組。復(fù)跳時間，A組明顯較B、C組延長（P＜0.05）。見表1。

2.2 血流動力學(xué)結(jié)果 見表2。血紅蛋白（Hb）和紅細(xì)胞比容（Hct）均可維持在目標(biāo)值范圍內(nèi)，PaO2，PaCO2處于正常范圍，但PaCO2波動較大。

平均動脈壓（MAP）：降溫前各組MAP無明顯差異，降溫復(fù)溫期間，不同的溫度對血壓的影響較大。停機(jī)后30 min MAP D、E組高于A、B、C組（P＜0.05），前兩組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），A組術(shù)后血壓高于B、C組（P＜0.05），后兩組之間無明顯差異（P＞0.05）。

心率（HR）：溫度對心率的影響較大，停機(jī)后30 min心率B、C組比較于D、E組有所減慢（P＜0.05），其他組之間未見有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 乳酸（Lac） 停循環(huán)前三個時間點，各組間Lac值無明顯差異。復(fù)溫后20 min，A、B、C三組Lac值明顯高于D、E組（P＜0.05），A、B、C三

組間，A組＜B組＜C組（P＜0.05）；停機(jī)前，A、B、C三組Lac值明顯高于D、E組（P＜0.05），A、B、C三組間，A組＜B、C組（P＜0.05），B、C組之間無統(tǒng)計學(xué)差異；停機(jī)后30 min，各組Lac數(shù)值均有下降趨勢，而B、C組顯著高于其他各組（P＜0.05）。

表1 各實驗動物基線資料（±s）

表1 各實驗動物基線資料（±s）

注：?與B組和C組比較P＜0.05。

表2 實驗過程中各時間點血氣分析比較（±s）

表2 實驗過程中各時間點血氣分析比較（±s）

注：?與D組和E組比較P＜0.05；＃A組與B組比較P＜0.05；△B組與C組比較P＜0.05。

3 討 論

神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙是患者DHCA術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，有數(shù)據(jù)表明，體外循環(huán)或DHCA術(shù)后，短暫的神經(jīng)功能障礙發(fā)生率為5.8%～28.1%，而不可逆的神經(jīng)功能損傷達(dá)到1.8%～13.6%［3］。低溫作為DHCA過程中神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的重要措施之一，一直備受爭議。低溫可以降低大腦的代謝率，減少興奮性遞質(zhì)谷氨酸鹽的釋放［4］，最近的研究表明，低溫可能通過誘導(dǎo)某些蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮主動保護(hù)作用［5］，另一方面，低溫可以引起凝血機(jī)制障礙，氧解離曲線左移，心肌收縮功能障礙等一系列并發(fā)癥，并且增加臨床輸血量［6］。如何選擇一個合適的溫度，既可以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受缺血缺氧損傷，又可以減少低溫相關(guān)的并發(fā)癥，是一個值得思考的問題。

建立簡便易行的大鼠模型對深低溫停循環(huán)過程進(jìn)行研究一直是研究人員關(guān)注的熱點。近年來，國內(nèi)外均有報道成功建立大鼠深低溫停循環(huán)模型，國內(nèi)一些文章報道采用夾閉頸動脈的方法達(dá)到腦缺血的效果［7-8］。2011年，Waterbury T等報道了大鼠無血預(yù)充的深低溫停循環(huán)模型的建立，通過降溫至18℃以下，模擬臨床停循環(huán)過程［9］。本課題組對大鼠深低溫停循環(huán)模型進(jìn)行了一定程度的改進(jìn)，并取得了良好的效果。

3.1 模型建立方法

3.1.1 停循環(huán)方式 大鼠腦組織主要由椎動脈和頸總動脈供血，夾閉頸動脈僅能使大腦處于一個相對缺血的狀態(tài)，而椎動脈仍然可以對大腦的部分區(qū)域進(jìn)行供血。臨床上DHCA過程中，大腦基本處于無血狀態(tài)，并非單純的缺血過程，夾閉頸動脈并不能完全模擬DHCA過程。另有采用單純降溫的方式使心臟停跳［9］，本實驗研究過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠體溫降至18℃以下時，大鼠的血壓仍有明顯的波形，心臟仍有微弱的跳動，單純采用降溫的方法無法使心臟按照既定的溫度要求停跳。綜合考慮多方面因素，本實驗采用了將大鼠全身血液引空的方式使心臟停跳，模擬大鼠腦組織完全缺血的狀態(tài)，其優(yōu)點在于：①更貼近臨床過程；②可以在任意溫度下模擬DHCA過程，研究不同溫度下各器官的病理生理過程。

3.1.2 溫度調(diào)控方式 實驗中的溫度控制裝置采用臨床變溫水箱和動物變溫器。目前大多文獻(xiàn)中報道的降溫復(fù)溫方式各不相同，然而，大部分均存在溫度控制不精確、效率不高等缺點。本實驗首次將臨床變溫水箱應(yīng)用于實驗，增加的管道預(yù)充量不會對實驗產(chǎn)生較大的影響，亦可以模擬臨床精確的控制大鼠體溫。

3.1.3 部分實驗方法的選擇 實驗過程采用滾壓泵，氣體麻醉，無血預(yù)充，更好的模擬了臨床過程，動脈插管采用尾動脈，避免了過去股動脈插管損傷大動脈的缺點。靜脈插管采用自制的靜脈采血針硅膠管，成功率高，取得了良好的效果。

3.2 實驗數(shù)據(jù)分析 從數(shù)據(jù)結(jié)果來看，相比較于常溫體外循環(huán)組和假手術(shù)組，30 min的停循環(huán)過程造成了DHCA組大鼠體內(nèi)大量無氧代謝產(chǎn)物L(fēng)ac的堆積，溫度越低，Lac數(shù)值越低，這從一個側(cè)面反應(yīng)了低溫可以通過降低能量的消耗來達(dá)到機(jī)體的保護(hù)作用。除2只死亡大鼠，各DHCA組的大鼠心臟均成功復(fù)跳，復(fù)跳時間與停循環(huán)溫度相關(guān)，B、C組停機(jī)后心率較其他組有所減慢，考慮可能由于在溫度較高的條件下，缺血對心肌功能的影響較大。術(shù)中恢復(fù)血流供應(yīng)后，各DHCA組均出現(xiàn)組織間隙滲出，停機(jī)后各組大鼠血壓均可平穩(wěn)維持，但是DHCA各組血壓相對較低，這可能與大鼠體內(nèi)血管擴(kuò)張，血管壁通透性增加相關(guān)。

3.3 實驗中存在的不足 本實驗中先后使用純氧和空氧混合氣體作為膜肺的氧合氣體，但是大鼠在實驗過程中出現(xiàn)了PaCO2下降，pH升高的呼吸性堿中毒表現(xiàn)，隨后改用二氧化碳壓力鋼瓶，利用二氧化碳和純氧的混合氣體對靜脈血進(jìn)行氧合，可以根據(jù)轉(zhuǎn)中大鼠的血氣值調(diào)節(jié)PCO2和PO2在合適的范圍。但二氧化碳壓力鋼瓶無法恒定維持CO2的流量，從而造成轉(zhuǎn)中PCO2數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)差增大。

總的來說，本實驗成功建立大鼠DHCA模型，和以往的模型相比，該模型使大腦處于完全缺血的狀態(tài)，并且溫度調(diào)控精確方便，對于研究不同溫度以及其他干預(yù)因素下DHCA對各臟器的影響有著積極的意義。

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Establishment of a temperature-controlled deep hypothermic circulatory arrest model without blood priming in rats

Zhu Xian，Lu Long，Zhao Xiang-dong，Sun Yan-hua，Wu Shu-bin，Liu Jin-ping，Ji Bing-yang，Yao Jian-min
Anhui Medical University，Anhui Hefei 230032，China；Departmen of Cardiopulmonary Center，the Military General Hospital of Beijing，Beijing 100700，China

Ji Bing-yang，Email：dr.ji.cpb＠gmail.com Yao Jian-min，Email：jimyao＠vip.sina.com

ObjectiveTo establish a temperature-controlled deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）model in rats with complete ischemic brain.MethodsTwenty three rats were divided into 5 groups，A：DHCA group 15℃-20℃（n＝5）；B：DHCA group 20℃-25℃（n＝5）；C：DHCA group 25℃-30℃（n＝5）；D：normthemic CPB group（n＝5）；E：sham group（n＝3）.After sevoflurane inhalation anesthesia，homemade multiorificed catheter was cannulated in right jugular vein for venous drainage.22G catheter was cannulated in left femoral artery for monitoring arterial blood pressure，20G catheter was cannulated in tail artery for the arterial inflow.Blood gas，homodynamic parameters，interval of cardiac recorvery were measured in six time points before the end of the process.ResultsTwenty one rats survived during the experiment，while two died.After heart resuscitation，comparing to D，E group，lactate of rats in three DHCA groups significantly increased，heart rate and blood pressure declined.ConclusionThe model could be used to study pathophysiology of brain and other organs caused by DHCA in different temperature and other interventions.

Deep hypothermic circulatory arrest；Rat；Model

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0107-05

2013-04-09）

2013-04-10）

230022合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)（朱 賢）；100700北京，北京軍區(qū)總醫(yī)院心肺一區(qū)（朱 賢、陸 龍、趙向東、姚建民）；100037北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，國家心血管病中心，阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)科（孫燕華、吳樹彬、劉晉萍、吉冰洋）

吉冰洋，Email：dr.ji.cpb＠gmail.com

姚建民，Email：jimyao＠vip.sina.com