生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測中的應(yīng)用

李蓉卓，劉 霞，李 蕾，李文進(jìn)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128)

生物傳感器在大腸桿菌O157∶H7檢測中的應(yīng)用

李蓉卓，劉 霞*，李 蕾，李文進(jìn)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128)

生物傳感器因其簡單、快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)越性越來越引起重視，已被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域。腸出血性大腸桿菌O157:H7自發(fā)現(xiàn)以來就被認(rèn)為是危害性很大的致病菌，并且在世界范圍內(nèi)曾多次暴發(fā)食源性疾病，已成為威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。因此，在食品安全領(lǐng)域，對大腸桿菌O157:H7檢測方法的研究已成為熱點。文章簡單介紹了生物傳感器的原理和分類，重點綜述了近年來生物傳感器在E.coli O157∶H7檢測中的應(yīng)用，并展望了其發(fā)展前景。

大腸桿菌O157∶H7；生物傳感器；檢測

0 引言

大腸桿菌O157∶H7(Escherichia coli O157:H7, E.coli O157:H7)是腸出血性大腸埃希氏桿菌的一個主要菌型[1]，自發(fā)現(xiàn)以來，已在世界范圍內(nèi)多次引發(fā)食源性疾病，污染的牛肉、牛奶、雞肉、蔬菜、果飲料等均可成為傳播媒介。人感染E.coli O157：H7，輕者會出現(xiàn)短暫腹瀉、惡心、嘔吐等癥狀，重者導(dǎo)致劇烈腹痛、出血性結(jié)腸炎、溶血性貧血、血小板減少性紫癜和溶血性尿毒綜合癥[2]。因此，對于E.coli O157：H7進(jìn)行快速、靈敏、實時檢測具有重要的應(yīng)用價值。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法[3~4]、生物發(fā)光法、細(xì)胞計數(shù)法等其檢測時間長（2~3 d）、靈敏度低等缺點已不能完全滿足現(xiàn)代E.coli O157：H7的檢測要求。生物傳感器因其特異性強、檢測速度快、靈敏度高、試樣用量少，操作簡便的優(yōu)勢，在微生物檢測領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用，特別是對E.coli O157∶H7的鑒定與檢測做了大量的研究工作。

該文簡單介紹了生物傳感器以及生物傳感器的類型，重點綜述了近年來生物傳感器在E.coli O157∶H7檢測中的應(yīng)用。最后對生物傳感器應(yīng)用于檢測E.coli O157∶H7的發(fā)展前景作出展望。

1 生物傳感器

生物傳感器[5]是生物學(xué)、電子信息學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等學(xué)科相互滲透、結(jié)合所發(fā)展起來的一種新型分析檢測技術(shù)。它是以固定的生物成分(蛋白質(zhì)、酶、DNA、抗體等)或生物體本身(細(xì)胞、微生物、組織等)作為敏感材料、與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物理換能器（如氧電極、光敏管、壓電晶體等等）及信號放大裝置相結(jié)合構(gòu)成的一種快速檢測各種生物、化學(xué)物質(zhì)的分析檢測儀器。它通過各種物理、化學(xué)換能器捕捉目標(biāo)物與敏感材料之間的反應(yīng)，然后，將反應(yīng)的程度轉(zhuǎn)變可測量的光信號或電信號，根據(jù)所測量信號的大小推算出被測物的多少[6]。根據(jù)生物傳感器所使用的檢測元件不同，可將其分為光學(xué)生物傳感器、壓電生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。與其他檢測技術(shù)相比，生物傳感器具有簡單、快速、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，具有良好的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

2 光學(xué)生物傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

2.1 表面等離子體共振 (sur face plasmon resonance,SPR)傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

SPR是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，該技術(shù)是利用光在高折射率玻璃表面的金或其它金屬材料薄膜發(fā)生全內(nèi)反射時的消失波，引發(fā)金屬表面的自由電子產(chǎn)生表面等離子體子（surface plasmons，SP）。在入射角或波長在某一適當(dāng)值的條件下，SP與消失波的頻率、波數(shù)相等，二者將發(fā)生共振。并在共振的條件下入射光被吸收，使反射光能量急劇下降，在反射光譜上出現(xiàn)共振峰 （反射強度最低值），當(dāng)金屬膜表面的介質(zhì)折射率不同時，共振峰位置也將不同。SPR對金屬表面的介質(zhì)折射率微小變化是極其敏感的，待測物與金屬薄膜接觸時若存在吸附、生化反應(yīng)或構(gòu)象的改變，則金屬表面的折射率就會發(fā)生變化，共振角隨即發(fā)生改變[7]，據(jù)此，可對待測物進(jìn)行檢測和分析。SPR傳感器具有顯著特點[8]：1)實時檢測；2)無需標(biāo)記樣品；3)靈敏度高；4）檢測時間短。

殷涌光等[9]利用抗體免疫吸附反應(yīng)，采用一次抗體-抗原-二次抗體的夾心免疫法，將膠體金抗體復(fù)合物作為第二抗體，并延長其與微生物的結(jié)合過程，穩(wěn)定和放大信號，從而顯著提高了檢測靈敏度。王凱等[10]通過采用親和素-生物素系統(tǒng)放大檢測的響應(yīng)信號,并引入復(fù)合抗體作為第二抗體，將SPR傳感器對E.coli O157∶H7的檢測限提高到了105CFU/mL，并且建立了細(xì)菌濃度與折射率對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，整個檢測過程在1 h內(nèi)完成。王一嫻等[11]利用SPR建立消減抑制反應(yīng)（subtractive inhibition assay） 方法檢測 E.coli O157∶H7，檢測靈敏度為3.0×104CFU/mL。后又引入生物凝集素作為受體[12]檢測E.coli O157∶H7，檢測限為3.0×103CFU/mL。Nancy等[13]應(yīng)用T4噬菌體作為識別元，基于SPR檢測E.coli O157∶H7，不到20 min就能完成檢測并且最低檢測限為103CFU/mL。Eum等[14]基于金納米粒子(gold nanorods，GNRs)的增強響應(yīng)信號作用，應(yīng)用三明治夾心法，將GNR標(biāo)記的抗體作為二抗，原抗體為一抗檢測E.coli O157∶H7，結(jié)果表明在標(biāo)記GNRs的前提下響應(yīng)信號比沒有標(biāo)記的高 3.8倍。SPR目前沒有大范圍應(yīng)用到實際檢測的重要原因是：SPR的檢測成本比較高，一次性使用的傳感芯片是檢測成本居高不下的重要因素。據(jù)此，多個實驗室已經(jīng)開展傳感芯片循環(huán)再生的相關(guān)研究工作。

2.2 熒光生物傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

熒光傳感器是通過測定特征熒光光譜對被測物進(jìn)行定性和定量檢測，能將分子識別事件通過熒光信號有效的表達(dá)，該傳感器在靈敏度和選擇性等方面具有突出的優(yōu)勢[15]。大多數(shù)無機化合物本身并不發(fā)熒光，還有一些物質(zhì)本身的熒光強度不足以進(jìn)行直接熒光分析，如某些蛋白質(zhì)等，可將特定的熒光探針與這些物質(zhì)形成復(fù)合物，利用該復(fù)合物所產(chǎn)生的熒光強度，對這些物質(zhì)進(jìn)行測定，從而擴大了熒光生物傳感器的應(yīng)用范圍。

Huang等[16]采用光譜表面等離子-熒光增強（long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy LRSP-FS)傳感器，多克隆抗體作為捕獲抗體，標(biāo)記了Alexa-fluorite-647的親和純化多克隆抗體作為檢測抗體，通過三明治免疫法檢測E.coli O157∶H7；LRSP的共振激發(fā)模式提供了一個高強度的電磁場，這種能量在檢測目標(biāo)物時起到增強熒光信號作用。該傳感器檢測時間為40 min，檢測限為10 CFU/mL。Tao等[17]應(yīng)用三明治免疫檢測法聯(lián)合熒光標(biāo)記物Alexa-Fluor檢測E.coli O157:H7。將多克隆抗體通過生物素—親和素作用固定在聚苯乙烯纖維波導(dǎo)管上作為捕獲抗體；與Alexa-Fluor 647共軛的抗體作為第二抗體，依據(jù)Alexa-Fluor 647的熒光信號對E.coli O157:H7進(jìn)行檢測。此傳感器檢測到純培養(yǎng)的E.coli O157:H7最低檢測限為103CFU/mL，人工接種的碎牛肉增菌4h就可檢測出1 CFU/mL。雖然熒光生物傳感器靈敏度很高，但在檢測大部分物質(zhì)時，需要將被測物進(jìn)行標(biāo)記，操作繁瑣，操作條件要求嚴(yán)格，不適合進(jìn)行現(xiàn)場檢測。

3 壓電生物傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

壓電生物傳感器是結(jié)合了壓電效應(yīng)的高靈敏性和生化反應(yīng)的高特異性的一種生物傳感器，主要由壓電晶體和生物分子識別系統(tǒng)組成。當(dāng)電壓施加于壓電晶體兩側(cè)的電極時，晶體會產(chǎn)生機械變形震蕩。當(dāng)電壓頻率達(dá)到晶體的固有頻率時，振幅最大，形成壓電諧振，此特定頻率稱為諧振頻率，諧振頻率與晶體的物理尺寸和性質(zhì)密切相關(guān)。當(dāng)晶體的表面沉積一定質(zhì)量的物質(zhì),它的諧振頻率就會發(fā)生改變。該頻率的改變與其表面沉積物質(zhì)的量之間存在一定線性關(guān)系。因此，如果晶體表面固定了生物識別分子，當(dāng)被分析物與生物識別分子相結(jié)合就會引起諧振頻率的變化，從而依據(jù)其響應(yīng)信號對分析物進(jìn)行檢測。

3.1 石 英 晶 體 微 天 平 （Quartz Crystal Microbalance.QCM）在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

QCM最基本的原理是利用了石英晶體的壓電效應(yīng)，主要由石英晶體傳感器、信號檢測和數(shù)據(jù)處理等部分組成，具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低、振動Q值大、靈敏度高、測量精度可以達(dá)到納克量級的優(yōu)點。石英晶體的介電和壓電常數(shù)穩(wěn)定性好，適合做工作溫度范圍很寬的傳感器。

WANG等[18]基 于 QCM 采用逐層組裝(polyelectrolyte layer-by-layer self-assembly，LBLSA)方法，將抗體固定到16巰基烷酸膜上，即一個尾端為羧基的烷烴硫醇長鏈，該膜是通過N2羥基琥珀酰亞胺作為媒介自組裝到石英晶體的金電極表面。目標(biāo)菌和抗體的結(jié)合使傳感器共振頻率降低，而頻率的變化和細(xì)菌的濃度有關(guān)。通過QCM和循環(huán)伏安法可得到該生物傳感器層層組裝產(chǎn)生的性質(zhì)變化。該法減少了檢測時間，得到E.coli O157∶H7的最低檢測限為2.0×102CFU/mL。Shen[19]應(yīng)用生物素放大技術(shù)，引入信標(biāo)免疫磁性納米粒子 (beacon immunomagnetic nanoparticles，BIMPs)和鏈霉親合素與金的復(fù)合物（streptavidin-gold），應(yīng)用QCM對E.coli O157∶H7進(jìn)行了高靈敏的檢測。該檢測利用磁納米粒子耦合的生物素化抗體，在樣品中捕獲E.coli O157∶H7，經(jīng)磁性分離后，得到了E.coli O157-BIMPs復(fù)合物，然后加入 streptavidin-gold與E.coli O157-BIMPs構(gòu)成生物素-親和素系統(tǒng)。最后混合液通入到已組裝了單克隆抗體的QCM進(jìn)行檢測。由于納米粒子、生物素-親和素的增強作用，在緩沖液、牛奶中分別檢測E.coli O157∶H7的靈敏度可達(dá)到23 CFU/mL、53 CFU/mL。諶志強等[20]基于QCM利用磁納米粒子與金納米粒子的增強響應(yīng)信號對E.coli O157∶H7進(jìn)行檢測。采用滴加的方法，分別將磁納米粒子和金納米粒子滴加在捕獲了E.coli O157∶H7的芯片表面，通過對比每一步的響應(yīng)信號及其總響應(yīng)信號，考查其增強效果，結(jié)果表明QCM在沒有兩種納米顆粒的放大作用下，其檢測限為104CFU/mL，而經(jīng)過兩級放大后，檢測下限達(dá)到10 CFU/mL。QCM的成本相對較高、耗時長等原因而沒有在實際應(yīng)用中得到廣泛的應(yīng)用。

3.2 其他壓電生物傳感器在E.coli O157∶H7檢測中的應(yīng)用

基于上述壓電傳感器的基礎(chǔ)，研究人員發(fā)展了其他技術(shù)來檢測E.coli O157:H7。Mao等[21]利用QCM DNA傳感器進(jìn)行E.coli O157∶H7的檢測，首先將E.coli O157:H7 eaeA基因的單鏈探針自組裝在QCM芯片表面，再與其生物素化的互補鏈雜交，然后加入與鏈霉親和素標(biāo)記的磁納米粒子來增強響應(yīng)信號，得到E.coli O157∶H7檢測限為2.67×102CFU/mL，檢測范圍為2.67×102～2.67×106CFU/mL。Poitras等[22]采用石英晶體損耗檢驗微天平 (QCM with dissipation monitoring, QCM-D)檢測E.coli O157∶H7，結(jié)果顯示檢測不同濃度的E.coli O157∶H7時，QCM-D耗散因子的變化比頻率變化更靈敏，檢測范圍是3×105～1×109cells/mL。

4 電化學(xué)生物傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

電化學(xué)生物傳感器是指由生物材料作為敏感元件，電極（固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等）作為轉(zhuǎn)換元件,利用待測物的電化學(xué)性質(zhì)，并將待測物化學(xué)量轉(zhuǎn)變成電信號進(jìn)行檢測的一種傳感器。電化學(xué)生物傳感器既能滿足一般檢測所需要的靈敏度和準(zhǔn)確性，又具有體積小、操作簡單、攜帶方便等特點，可用于現(xiàn)場檢測。依據(jù)產(chǎn)生信號的不同，電化學(xué)傳感器可以分為阻抗型傳感器、電流型傳感器、電壓型傳感器等。

4.1 阻抗傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

電化學(xué)阻抗傳感器是一種以小振幅的正弦波電位（或電流）為擾動信號的化學(xué)測量方法。由于以小振幅的電信號對體系擾動，一方面可避免對體系產(chǎn)生大的影響，另一方面也可以使得擾動與體系的響應(yīng)之間近似成線性關(guān)系，從而使測量結(jié)果的數(shù)學(xué)處理變得簡單。同時，電化學(xué)阻抗方法又是一種頻率域的測量方法，它以測量得到的頻率范圍很寬的阻抗譜來研究電極系統(tǒng)，因而能比其他常規(guī)電化學(xué)方法得到更多的動力學(xué)信息及電極界面結(jié)構(gòu)的信息[23]。

李杜娟等[24]將抗體固定在A蛋白修飾的石英晶體金電極表面，采用三電極系統(tǒng)，即工作電極（石英晶體金電極）、參考電極（Ag/AgCl/Cl-）和鉑對電極，應(yīng)用電化學(xué)阻抗生物傳感器快速檢測了E.coli O157：H7。 結(jié)果表明，在[Fe(CN)6]32/42氧化還原對存在的情況下，抗體的固定以及抗原與抗體的結(jié)合都增加了石英晶體金電極表面的電子傳遞阻抗，且石英晶體金電極的電子傳遞阻抗變化值與E.coli O157：H7的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限是103CFU/mL，檢測時間不超過10 min。Varshney等[25]將金交叉式陣列微電極與磁性納米粒子相結(jié)合應(yīng)用于阻抗傳感器，快速檢測了牛肉樣品中的菌體，可檢測到1.2×103cells的E.coli O157:H7，整個檢測過程只需要35 min。Li等[26]利用金納米粒子與殼聚糖多壁碳納米管復(fù)合物和SiO2/硫堇，將其逐層自組裝于電極表面，從而增強了阻抗傳感器的靈敏度，使得E.coli O157:H7的檢測線性范圍達(dá)到4.12×102～4.12×105CFU/mL，整個檢測過程少于 45 min。Majed等[27]基于交叉指型微金電極(interdigitated microelectrode，IME)阻抗傳感器檢測E.coli O157: H7。該方法不是利用抗原抗體結(jié)合進(jìn)行檢測的，而是通過阻抗的改變值計算電極表面附著E.coli O157:H7的量。阻抗值的頻率范圍是100 Hz～10 MHz，E.coli O157:H7檢測范圍是2.5×104～2.5×107CFU/mL。

4.2 電流型傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

電流型傳感器是通過設(shè)定一定值的電位，被測物直接或者間接的與電極表面的識別分子發(fā)生反應(yīng)，從而引起電流的變化，通過電流的改變可以得出被測物的反應(yīng)情況與反應(yīng)物質(zhì)的量。

Setterington等[28]將E.coli O157:H7用免疫磁珠從樣品中磁性分離后，引入到生物功能化的導(dǎo)電聚苯胺 （immuno-PANI)修飾的工作電極表面，利用循環(huán)伏安法檢測E.coli O157:H7?；诰郾桨返姆糯笮盘栕饔?，檢測最低限為7 CFU（原始的濃度70 CFU/mL）。整個過程從取樣到檢測僅需要70 min。從電流型傳感器研究的情況來看，目前仍在尋找更合適的固定方法和固定材料，探求更靈敏穩(wěn)定的標(biāo)記體系和電活性物質(zhì)，追求更完美的信號檢出系統(tǒng)。

5 其他傳感器在E.coli O157：H7檢測中的應(yīng)用

除了上述生物傳感器對E.coli O157：H7進(jìn)行檢測，目前也發(fā)展了一些其他傳感器檢測方法，如李延斌等[29]利用不同長度微流體通道，基于微流體晶片的光學(xué)生物感應(yīng)方法檢測E.coli O157：H7，檢測限達(dá)到10～100 cell/mL，并且不采用增菌手段，檢測在2 h內(nèi)完成。馬靜等[30]建立了一種快速檢測E.coli O157：H7的新型酶免疫傳感器，利用靜電吸附作用和抗原抗體特異性結(jié)合將E.coli O157:H7單克隆鼠抗固定在辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG/納米金修飾的玻碳電極表面，制備了用于檢測E.coli O157：H7的酶免疫傳感器。檢測下限為1×102CFU/mL,檢測線性范圍是1×103～1×105CFU/mL。Luo等[31]采用基于靜電紡絲技術(shù)的電導(dǎo)型傳感器檢測了 E.coli O157:H7。將E.coli O157:H7多克隆抗體固定在經(jīng)過靜電紡絲納米膜修飾的傳感器表面。再將磁納米粒子標(biāo)記的抗體與待測樣品充分混合，經(jīng)磁性分離純化后，通入到傳感器進(jìn)行檢測。整個檢測時間8 min，檢測限為61 CFU/mL，在10 CFU/mL～104CFU/mL范圍成線性關(guān)系。

6 總結(jié)和展望

生物傳感器的問世使得微生物檢測過程變得更為簡單，且容易實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測。但是，目前一些生物傳感器還存在一些方面的限制。比如：①靈敏度還需要進(jìn)一步提高。目前實驗室研究的E.coli O157:H7檢測限都在103CFU/mL左右，而實際應(yīng)用要求檢測限要達(dá)到個位數(shù);②目前大多數(shù)生物傳感器檢測E.coli O157:H7，其特異性主要依賴于抗體，需進(jìn)一步研發(fā)其它特異性識別分子，以降低檢測成本；③生物傳感器的使用壽命還需要進(jìn)一步延長。隨著微電子技術(shù)、材料學(xué)、生物技術(shù)、信息技術(shù)的快速發(fā)展，上述問題均會得到改善。在食品中E.coli O157:H7檢測方面，生物傳感器必將成為一種簡便、快速、靈敏的現(xiàn)代檢測技術(shù)。

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Application of the biosensor for detection E.coli O157:H7

Li Rong-zhuo，Liu Xia*，Li Lei，Li Wen-jin
(College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

Biosensor has been widely applied in various fields owing to its simplicity,rapid,strong specificity,and high selectivity.Escherichia coli O157:H7(E.coli)is an important enterohemorrhagic pathogen,which is considered to be the very dangerous.The food-borne diseases have frequently broken out as a result of E.coli O157:H7 in the world.At present,E.coli O157:H7 has become a global public health problem.Therefore,the study of detection method for E.coli O157:H7 has become a hot spot in the area of food safety.This article provides an overview of biosensor for detection E.coli O157:H7.

E.coli O157:H7;biosensor;detection

國家自然科學(xué)基金(31201375)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目(10B050)

*通訊聯(lián)系人，E-mail：liuxiaspr@gmail.com