固相微萃取及其在水產(chǎn)品風(fēng)味分析中的應(yīng)用*

徐永霞，劉瀅，姜程程，朱丹實，勵建榮，趙葳

1(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州，121013)2(大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧大連，116001)

固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)是由加拿大Waterloo大學(xué)Pawliszyn研究小組［1］于20世紀80年代末提出的，該技術(shù)是一種比較實用的樣品前處理技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于食品基質(zhì)中揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物的提取［2-4］。相比傳統(tǒng)方法，固相微萃取具有操作簡單、快速、無需有機溶劑，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的特點，同時可避免風(fēng)味成分的損失和變化，得到完整、真實的分析結(jié)果［5］。

水產(chǎn)品因其具有較高的營養(yǎng)價值，且具有獨特的風(fēng)味，受到人們的廣泛青睞，其中風(fēng)味又是評價水產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標［6］。水產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)通常分為非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)兩大類。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)決定了食品的特征滋味，同時大部分非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)也是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體;而提供氣味的物質(zhì)屬揮發(fā)性物質(zhì)，因而可稱為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)［7］。本文所討論的水產(chǎn)品風(fēng)味，主要是指水產(chǎn)品中的揮發(fā)性風(fēng)味。

水產(chǎn)品的風(fēng)味成分一般種類繁多、穩(wěn)定性較差、含量甚微［8］。盡管國內(nèi)外學(xué)者對水產(chǎn)品風(fēng)味進行了較多的研究［9-10］，但對其了解仍相對有限。本文闡述了SPME技術(shù)及其發(fā)展，綜述了該技術(shù)在水產(chǎn)品風(fēng)味分析中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并對其應(yīng)用前景進行了探討。

1 固相微萃取技術(shù)

1.1 固相微萃取技術(shù)概述

固相微萃取裝置由萃取頭和萃取手柄2部分組成，根據(jù)有機物與溶劑之間的“相似相溶”原理，以熔融石英光導(dǎo)纖維或其他材料對樣品中的有機分子進行萃取并富集等過程。當(dāng)萃取樣品的時候，露出萃取頭浸漬在樣品中，或置于樣品上空進行頂空萃取，有機物就會吸附在萃取頭上，一定時間后吸附達到平衡，把萃取頭收縮到鞘內(nèi)，固相微萃取裝置撤離樣品，完成樣品的萃取過程［11］。SPME不是將待測物全部萃取出來，其原理是建立在待測物的固定相和水相之間達成的平衡分配基礎(chǔ)上。SPME技術(shù)有3種萃取方式，一種是將萃取纖維直接暴露于樣品中的直接萃取法，適用于分析氣體樣品;一種是將纖維暴露于樣品頂空中的頂空萃取法，適用于半揮發(fā)性有機化合物的分析;另一種是通過一個選擇性的高分子材料膜將試樣與萃取頭分離的膜保護萃取法，該方法對難揮發(fā)性組分的萃取富集更為有利。

1.2 固相微萃取技術(shù)的發(fā)展

1.2.1 SPME 涂層新材料的開發(fā)

萃取頭是SPME的核心部分。其涂層的種類和厚度由目標組分的分配系數(shù)、極性、沸點等參數(shù)來確定。最早使用的高分子涂層材料是具有單一涂層的聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PA)等，這些單一涂層在有機溶劑中溶脹性較大，使用壽命較短，萃取效果較差。近年來，一些復(fù)合固相涂層如聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB)、聚乙二醇-模板樹脂(CW-TPR)以及石墨碳黑、鍵合硅膠、溶膠-凝膠等新型涂層材料相繼研發(fā)出來［12］，這些新型涂層材料具有更長使用壽命和穩(wěn)定性以及更好的萃取能力。

1.2.2 固相微萃取條件的優(yōu)化

一些分析者關(guān)注于SPME測定結(jié)果的重現(xiàn)性和對低濃度組分的檢測靈敏度，然而纖維頭上涂層聚合物的極性和厚度、萃取溫度、時間、樣品體積、pH值等因素也都會影響萃取結(jié)果。因此，使用SPME法時必須優(yōu)化萃取條件。現(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者采用不同的試驗設(shè)計方法對萃取條件進行優(yōu)化，使實驗結(jié)果更準確。目前，研究者對萃取條件的優(yōu)化主要集中在萃取頭、萃取溫度、萃取時間、離子濃度、質(zhì)量濃度及體系pH值等方面。根據(jù)相似相溶原理，不同的萃取頭固相涂層及厚度對揮發(fā)性成分的萃取吸附能力不同［13］。應(yīng)根據(jù)組分在各相中的分配系數(shù)、極性與沸點選擇合適的萃取頭。SPME中樣品的提取和富集是一個動力學(xué)過程，樣品中各相的分配系數(shù)決定著樣品的萃取效率。而樣品的分配系數(shù)是一個熱力學(xué)常數(shù)，溫度是其重要的影響參數(shù)［14］。萃取時間是從石英纖維與試樣接觸到吸附平衡所需要的時間，該因素受萃取頭、分配系數(shù)、樣品的擴散系數(shù)、頂空體積、樣品萃取溫度等條件限制［15］。利用鹽離子效應(yīng)，降低被分析物(有機物)在水溶液中的溶解性，使更多的揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)至溶液的頂空，吸附到萃取頭上，從而提高風(fēng)味物質(zhì)的吸附量。適當(dāng)調(diào)節(jié)體系pH值，可防止液體試樣中待測物質(zhì)離子化，使其處于分子狀態(tài)，增加親脂性，降低溶解度，提高萃取效率。

1.2.3 SPME 聯(lián)用技術(shù)

自1994年SPME商品化以來，該技術(shù)取得了較快發(fā)展，其最大特點之一便是可與多種儀器聯(lián)用，協(xié)同完成測定及結(jié)果分析。目前將SPME與GC、MS技術(shù)聯(lián)用進行風(fēng)味分析已很普遍，而多維色譜的發(fā)展極大地改善了復(fù)雜基質(zhì)中有機物的分離，其中全二維氣相色譜(GC×GC)作為研究復(fù)雜基質(zhì)中揮發(fā)性成分的一個強大分析技術(shù)，與MS聯(lián)用可以對組分進行更準確定性。Adahchour等［16］采用HS-SPME-GC×GCFID檢測大蒜揮發(fā)性成分時，發(fā)現(xiàn)比采用一維色譜的靈敏度增加了10～50倍;Stanimirova等［17］采用HSSPME-GC×GC-TOF-MS分析了不同地區(qū)及不同蜜源植物來源的蜂蜜的揮發(fā)性成分。為了鑒定食品中的氣味活性成分，SPME與氣相色譜嗅聞技術(shù)(GC-O)在食品風(fēng)味研究中也得到了迅速發(fā)展。張青等［18］采用SPME-GC-O初步探索出己醛、庚醛、辛醛等對鰱魚的整體風(fēng)味起重要作用。1995年，Pawliszyn等人提出了SPME-HPLC聯(lián)用技術(shù)，次年Supelco公司推出了商品化的聯(lián)用儀接口。Sarrion等［19］將SPME與HPLC聯(lián)用測定環(huán)境水樣中幾種氯酚物質(zhì)的濃度，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)快速靈敏。隨著科技的不斷發(fā)展，SPME與電子鼻或嗅覺測定裝置的聯(lián)用技術(shù)也將會更加完善。

1.2.4 定量分析

用于風(fēng)味分析的定量方法主要有面積歸一法、內(nèi)標法、外標法、標準加入法。目前國內(nèi)多采用歸一化法進行定量分析，此法簡單有效，可用來進行半定量，獲取大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但是在風(fēng)味研究中往往需采用風(fēng)味活性值(OAV)來評價某種物質(zhì)對食品風(fēng)味的重要程度，因此，需要對風(fēng)味成分進行準確定量。目前國外常使用內(nèi)標法，內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物，該法可以消除實驗操作中的誤差，克服歸一法的缺點，檢測結(jié)果也更準確。而標準加入法實質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標法，是在選擇不到合適的內(nèi)標物時，以欲測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標物，加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入欲測組分純物質(zhì)前后欲測組分的峰面積 (或峰高)，從而計算欲測組分在樣品中的含量的方法。外標法也稱為標準曲線法或直接比較法，是用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標法。該方法是一種簡便、快速的絕對定量方法(歸一化法則是相對定量方法)［20］。

2 固相微萃取技術(shù)在水產(chǎn)品風(fēng)味分析中的應(yīng)用

2.1 魚類

SPME技術(shù)在魚類風(fēng)味分析方面已得到廣泛應(yīng)用。魚的氣味與其種類、不同部位及新鮮度等有很大關(guān)系，同時，不同加工方式對魚風(fēng)味也有很大影響。

Béné等［21］用 SPME 與 GC-FID 及 GC-NPD 聯(lián)用測定儲藏20d后生魚中揮發(fā)性胺的含量以評判其新鮮度。Iglesias等［22］采用HS-SPME-GC-MS法分析了與魚肉氧化有關(guān)的揮發(fā)性成分，證明1-戊烯-3-醇、2，3-戊二酮和1-辛烯-3-醇含量與化學(xué)指標如過氧化值、硫代巴比妥酸值高度相關(guān)，因此認為此法可有效監(jiān)測魚肉酸敗情況，且快速靈敏。蔡原等［23］采用 HSSPME-GC-MS研究了虹鱒不同部位魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，結(jié)果表明煮熟后的虹鱒背肉和腹肉的肉香明顯優(yōu)于尾部，被檢出的醇類化合物主要是1-辛烯-3-醇等不飽和醇及戊醇、己醇等飽和醇類。蘇麗等［24］探索了干燥前后鰱魚揮發(fā)性成分的變化，通過實驗得出:腌制對鰱魚的風(fēng)味影響不大，僅有少量物質(zhì)發(fā)生變化，而干燥過程對鰱魚的風(fēng)味影響較大，干燥過程中風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量有顯著變化。

Josephson等［25］認為，一些相對分子質(zhì)量低的醛類化合物對蒸煮以后魚的特征香味有貢獻，尤其是一些烯醛類及二烯醛類化合物。如2，4-庚二烯醛、2-辛烯醛、2-壬烯醛、2，4-癸二烯醛等對蒸煮以后魚肉的特征香味貢獻更大。Hanne等［26］對香魚特有香氣進行研究，結(jié)果表明，(E，Z)-2，6-壬二烯醛、(E)-2-壬烯醛、3，6-壬二烯-1-醇等C9羰基化合物和醇類密切相關(guān)。Wierda 等［27］發(fā)現(xiàn)，己醛、辛醛、(E)-2-戊烯醛和(E)-2-己烯醛是新鮮大馬哈魚的表征物質(zhì)，而羥基丁酮、乙苯、丙苯、苯乙烯、3-甲基丁酸及乙酸是腐敗大馬哈魚的潛在標記物。

2.2 蝦類

SPME法也用于提取一些蝦類的風(fēng)味成分。解萬翠等［28］對北極蝦蝦頭的揮發(fā)性成分進行研究發(fā)現(xiàn)，含量較高的(Z，E)-3，5-辛二烯-2-酮和(E，E)-3，3-辛二烯-2-酮等以甜的、新鮮的蘑菇風(fēng)味成為蝦頭風(fēng)味特征的主要貢獻;醋酸乙酯等脂類化合物和1-戊烯-3-醇、2-乙基-1-己醇及 1-辛烯-3-醇等醇類化合物對蝦頭特征風(fēng)味也有較大貢獻。另外，蝦頭三甲胺等物質(zhì)的含量達12.61%，是蝦頭明顯的腥味和蝦的特征風(fēng)味。研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯、二甲基二硫醚、吡嗪、3-甲基噻唑、2，5-二甲基吡嗪，2，6-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、二甲基三硫醚、2-戊酮、2-庚酮、2，3-庚二酮、2-辛酮、3-甲基-2-丁烯醛、甲基吡嗪、苯乙酮、噻唑醇、苯甲醇、2-呋喃、甲醇等化合物是使蝦呈現(xiàn)香味的物質(zhì)［29-31］。Jaffre 等［32］采用 SPMEGC-MS技術(shù)研究了能夠表征去皮煮熟的熱帶蝦腐敗變質(zhì)的揮發(fā)性物質(zhì)主要是3-甲基-1-丁醛、2，3-丁二酮、3-甲基-1-丁醛、2，3-庚二酮及三甲胺。

目前，有很多學(xué)者采用SPME法對蝦酶解物中的揮發(fā)性成分進行了研究，為更好地開發(fā)和利用蝦類水產(chǎn)品提供了依據(jù)。錢飛等［33］對克氏原螯蝦頭酶解物的揮發(fā)性成分進行研究發(fā)現(xiàn)，SPME法主要用于檢出酶解物中的“香氣”組分，SDE法檢測出其中的“香味”成分，將2種方法結(jié)合起來，可以更好地分析酶解物的揮發(fā)性成分。付光中等［34］對凡納濱對蝦蝦頭酶解產(chǎn)物發(fā)酵前后揮發(fā)性成分進行了比較，得出的結(jié)論是，蝦頭酶解產(chǎn)物經(jīng)混合發(fā)酵后，香味物質(zhì)在原有的蝦風(fēng)味組分較好保留的基礎(chǔ)上更加豐富，具有刺激性氣味的飽和直鏈醛減少。劉曉娟等［35］采用 HSSPME-GC-MS分析了毛蝦酶解液揮發(fā)性成分，結(jié)果表明，酶解后酮類、吡嗪類和含氮、含氧、含硫化合物的增加和刺激性氣味的醛類物質(zhì)含量的減少是酶解液風(fēng)味優(yōu)于提取液的主要原因。

2.3 蟹類

生鮮蟹肉氣味平淡，加熱蒸煮時產(chǎn)生濃厚的香味，具有獨特的風(fēng)昧。目前，國內(nèi)對蟹的研究主要集中于蟹肉品質(zhì)分析以及加工工藝等方面［36-38］，對其揮發(fā)性物質(zhì)的研究較少。顧賽麒等［39］采用 HSSPME-GC-MS聯(lián)用及電子鼻技術(shù)綜合分析了中華絨螯蟹不同可食部位的香氣成分，通過主成分分析得到，2-乙基呋喃、己醛、壬醛為表征大閘蟹性腺的特征性活性香氣物質(zhì);檸檬烯和癸醛分別是表征鉗肉及足肉的特征性活性香氣物質(zhì)。陳舜勝等［40］采用 HSSPME法研究中華絨螯蟹蟹肉揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)，戊醛、己醛、庚醛、壬醛和癸醛較海水蟹類含量高，這可能是造成淡水蟹肉中具有一定土腥味的原因。Hsieh等［41］發(fā)現(xiàn)2-戊基呋喃對于小龍蝦和蟹肉的風(fēng)味有負面的貢獻，它也被報告在一些脂肪和油中有異常風(fēng)味的效應(yīng)并且給貯存的大豆油以一種豆和草的氣味［42］。顧賽麒等［43］研究鋸緣青蟹揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，3-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、苯甲醛、壬醛、癸醛、正辛醇這8種化合物可能是青蟹典型的揮發(fā)性風(fēng)味物。這與Yu等［44］、蔣根棟等［45］對鋸緣青蟹揮發(fā)物分析的結(jié)果一致。Zhang等［46］通過HS-SPME法推測三甲胺是紅斑梭子蟹等海產(chǎn)品腐敗的標志性揮發(fā)性物質(zhì)。

2.4 貝類

貝類中的風(fēng)味成分非常復(fù)雜，其中包括醇類、醛類、酯類、酮類、烴類等有機物質(zhì)。近年來，SPME在貝類風(fēng)味成分分析方面得到迅速的發(fā)展。孫玉亮等［47］采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對比扇貝豆醬發(fā)酵前后香氣成分的變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后扇貝豆醬中悅?cè)讼銡獾姆宇悺Ⅴヮ?、醛類、酮類等物質(zhì)含量都相應(yīng)增加，使整體香氣協(xié)調(diào)。顧聆琳等［48］采用SPME分析牡蠣中的風(fēng)味物質(zhì)，并結(jié)合GC-MS對風(fēng)味物質(zhì)進行分析鑒定，結(jié)果顯示出烴類以及1-辛烯-3-醇、4-壬烯醛、2-辛醛等對生牡蠣的風(fēng)味有較大的影響;而3-戊烯-2-酮、1-戊烯-3-酮、2-壬酮、苯甲醛、庚醛、壬醛、丁香醛、(Z)-4-庚烯醛等對煮制后的熟牡蠣的風(fēng)味有較大的作用，因此可以看出，煮制對牡蠣的風(fēng)味有很大影響。而黃健等［49］研究新鮮及100℃加熱和150℃加熱牡蠣揮發(fā)性風(fēng)味成分的對比，得到的結(jié)果是己醛、(E，Z)-2，6-壬二烯醛、庚醛、辛醛等醛類物質(zhì)是使新鮮牡蠣具有腥味、蘑菇及黃瓜風(fēng)味的物質(zhì);醛類和雜環(huán)化合物的風(fēng)味是使牡蠣經(jīng)100℃加熱后腥味減弱，肉香濃郁的主要因素;150℃加熱牡蠣的主要揮發(fā)性物質(zhì)是烴類，而雜環(huán)化合物對其烘烤風(fēng)味的形成具有重要作用。白雪等［50］通過SPME-GC-MS法測定了朝鮮薊中的風(fēng)味成分，從鑒定結(jié)果來看，朝鮮薊可食部位呈味物質(zhì)主要是4(14)，11-桉葉二烯、石竹烯、3-羥基丙酸環(huán)丁烷硼酸酯和4-十八烷基嗎啉等;不可食部位的揮發(fā)性物質(zhì)主要為4(14)，11-桉葉二烯、角鯊烯、石竹烯、己醛、1-十五烯等化合物含量最高，兩種部位既含有相同風(fēng)味成分，同時兩者的氣味又具有很大差異。

目前，國外學(xué)者對貝類風(fēng)味成分的研究也很深入。Linder等［51］利用SPME分析了扇貝中的揮發(fā)性化合物和總脂質(zhì)。從閉殼肌中共檢測得到一些以醛類和酮類為主的化合物，可作為鮮活扇貝的風(fēng)味指標物并作為衡量其質(zhì)量狀況的揮發(fā)性物質(zhì)。Zhang等［52］采用HS-SPME分析牡蠣在貯藏過程中揮發(fā)性成分的變化時發(fā)現(xiàn)腐敗牡蠣中1，3-二乙烯基苯的含量很高，并且對比了單一HS-SPME或SD和兩者結(jié)合萃取揮發(fā)性成分的效果得出后者的萃取效果更好。Tuckey等［53］通過SPME并結(jié)合GC-MS儀分析了貽貝中揮發(fā)性物質(zhì)的變化，結(jié)果表明二甲基硫、1-戊烯-3-醇、1-己烯-3-醇、1-辛烯-3-醇的含量在貯藏期間內(nèi)顯著升高，而戊醛、己醛、庚醛、辛醛及3-十一烯-2-酮的含量隨貯藏時間延長逐漸降低。

2.5 藻類

有關(guān)藻類揮發(fā)性成分的研究，主要集中在干藻藻體本身揮發(fā)出來的成分和干物質(zhì)在加熱時產(chǎn)生的成分。陳婉珠等［54］采用HS-SPME-GC-MS分析了海帶中的腥味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)3-羥基-1-辛烯醇、愈創(chuàng)藍油烴、異丙基豆蔻酸酯、十六烷酸、四甲基十七烷這5種物質(zhì)共同形成了海帶特殊的藻腥味。常城等人［55］研究了裙帶菜提取物的揮發(fā)性物質(zhì)并將其添加到煙卷中能明顯降低煙氣的雜氣和刺激性，使煙氣更為細膩，回甜感增加。虞銳鵬等［56］為確定對藍藻異味起主要作用的化合物，采用HS-SPME研究了藍藻水華水體中的揮發(fā)性物質(zhì)，推測二甲基三硫、二甲基二硫及β-檸檬醛為藍藻水華暴發(fā)后增加最明顯的惡臭物質(zhì)。

3 SPME技術(shù)展望

SPME作為一種簡單而實用的樣品前處理技術(shù)，在水產(chǎn)品風(fēng)味分析方面十分廣泛。然而SPME技術(shù)仍存在一定缺陷，如涂層種類有限，萃取針頭的使用壽命短，對于復(fù)雜基質(zhì)樣品萃取的選擇性和重現(xiàn)性還不太理想等。因此，研制萃取效率高、使用壽命長、抗干擾能力強的萃取涂層非常重要。

水產(chǎn)品風(fēng)味組成復(fù)雜，成分較多，SPME技術(shù)在其領(lǐng)域中的應(yīng)用研究還需要進一步加強。目前，隨著高通量自動化聯(lián)用儀器和快速數(shù)據(jù)處理技術(shù)的不斷出現(xiàn)，該技術(shù)將能更快速高效地分析水產(chǎn)品中復(fù)雜的風(fēng)味組成，這對于水產(chǎn)品風(fēng)味形成機理和產(chǎn)生途徑等方面具有重要意義。相信隨著研究的不斷深入，該技術(shù)將在水產(chǎn)品新鮮度評價、品質(zhì)預(yù)測以及影響水產(chǎn)品品質(zhì)的不良風(fēng)味成分和污染物的檢測等方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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