肝豆?fàn)詈俗冃缘难芯窟M(jìn)展（一）

楊健

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，海南?？?70102)

·綜述·

肝豆?fàn)詈俗冃缘难芯窟M(jìn)展（一）

楊健

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，海南海口570102)

肝豆?fàn)詈俗冃允且环N常染色體單基因隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，其致病基因ATP7B定位于染色體13q14.3，編碼一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶。1912年Kinnier Wilson首先報(bào)道本病，近年來(lái)WD的研究已取得喜人的進(jìn)展。1989年WD基因被準(zhǔn)確定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。本病的診斷主要采用血清銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，CP)、血清銅、尿銅、肝實(shí)質(zhì)銅及基因檢測(cè)。治療方法包括飲食治療、藥物治療、手術(shù)治療和對(duì)癥治療，其中藥物治療主要采用青霉胺、鋅鹽及曲恩汀(Trientine)。肝移植是唯一可以治愈本病的治療措施，細(xì)胞移植治療及基因治療尚處實(shí)驗(yàn)研究階段。本文就本病的歷史研究進(jìn)程及新近的診治進(jìn)展做一綜述。

肝豆?fàn)詈俗冃裕辉\斷；治療；進(jìn)展

肝豆?fàn)詈俗冃?Hepatolenticular degeneration，HLD也稱wilson病，以下簡(jiǎn)稱WD)是一種常染色體單基因隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，其致病基因ATP7B定位于染色體13q14.3，編碼一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶。ATP7B基因突變導(dǎo)致ATP7B功能減弱或喪失，導(dǎo)致血清銅藍(lán)蛋白合成減少以及膽道排銅障礙，蓄積體內(nèi)的銅離子在肝、腦、腎、角膜等處沉積，引起進(jìn)行性加重的肝硬化、錐體外系癥狀、精神癥狀、腎損害及角膜色素環(huán)(Kayser-Fleischer ring，k-F環(huán))等[1-3]。本病的患病率大約為1/3萬(wàn)，而致病基因的攜帶率為1/90?，F(xiàn)就本病的歷史研究進(jìn)程及新近的診治進(jìn)展綜述如下：

1 歷史沿革

1912 年Wilson[1]報(bào)道一種累及肝臟及大腦豆?fàn)詈?Lenticular nucleus)的新疾病。盡管他耗盡終生精力去尋找成功的治療方法，但卻始終未能如愿。1913年Rumpel[4]發(fā)現(xiàn)這種患者死后的肝臟內(nèi)含有大量的銅，因此，他推測(cè)銅是這種疾病的始作俑者。直到1948年止，本病的探索似乎被人們擱置下來(lái)而未予更大的關(guān)注。1948年Cumings[5]證明肝豆?fàn)詈俗冃缘幕颊叽竽X和肝臟內(nèi)有大量的銅累積。這種發(fā)現(xiàn)使他聯(lián)想到用英國(guó)剛生產(chǎn)的鰲合劑(Chelating agent)——抗路易士藥劑(Antilewisite，也稱Dimercaprol，二巰基丙醇，常用作砷、汞等中毒的解毒劑)來(lái)阻止疾病的進(jìn)展。一般說來(lái)，在治療學(xué)上的主要進(jìn)展都是由許多跨國(guó)制藥公司所創(chuàng)造的，它們生產(chǎn)的藥物既安全又有效。然而，1982年Fred karch把治療肝豆?fàn)詈俗冃缘乃幬餁w類為“罕用藥”(Orphan drugs)范疇，迄今為止七個(gè)報(bào)批的新藥都是由個(gè)別研究人員所發(fā)現(xiàn)。因此，可以說推動(dòng)肝豆?fàn)詈俗冃匝芯考叭〉玫闹匾M(jìn)展，大多是來(lái)自個(gè)別研究人員的成就而不是大公司所為。事實(shí)上，許多制藥公司都按照自由市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的潛規(guī)則運(yùn)作，它們研究和生產(chǎn)的新藥主要針對(duì)常見病，因?yàn)橹挥羞@樣才能獲得巨額利潤(rùn)?，F(xiàn)在介紹一個(gè)新藥的費(fèi)用大約需要8億美元?；谏鲜鲈?，研究和和生產(chǎn)針對(duì)少見病的藥物少有人問津，這也是情理之中的事情[6]。

WD的情況也是如此。到目前為止，所有能使用治療的藥物都是個(gè)體或小團(tuán)隊(duì)研究的產(chǎn)物。肝豆?fàn)詈俗冃灾委煹墓适虏皇鞘加?948年Cumings建議用二巰基丙醇，早在1939年第二次世界大戰(zhàn)時(shí)，由于害怕希特勒使用含砒霜的軍用毒氣——?jiǎng)⒁资慷練?Lewisite)襲擊不列顛群島，在Rudolph peters爵士的領(lǐng)導(dǎo)下，一個(gè)牛津大學(xué)的生物化學(xué)教授小團(tuán)隊(duì)開始研究解毒劑。這項(xiàng)研究的成果于1945年公開發(fā)表[7]。他們?cè)O(shè)計(jì)的二巰基丙醇分子具有二個(gè)替代巰基(-SH)的短鏈醇(Short-chain alcohol)，上述巰基使二巰基丙醇牢固地結(jié)合砒霜中五個(gè)環(huán)，從而使后者失去活性。后來(lái)這種化合物便稱作英國(guó)的抗路易士劑(British antilewisite，BAL)。Cumings推測(cè)這種化合物可能會(huì)阻止肝豆?fàn)詈俗冃缘倪M(jìn)展，四年以后的1951年，Cumings[8]在倫敦，而Denny Brown和Porter在波士頓市醫(yī)院[9]分別報(bào)道這種藥物有效。然而，隨著二巰基丙醇的反復(fù)使用，其療效越來(lái)越差，而毒性反應(yīng)高居不下的發(fā)生率卻明顯凸現(xiàn)出來(lái)。除此之外，尚有由于深部肌注所帶來(lái)的通宵達(dá)旦的疼痛。

WD研究真正發(fā)生質(zhì)的飛躍是發(fā)生在上世紀(jì)50年代，1952年，Bearn等[10]和Scheinberg等[11]分別報(bào)道肝豆?fàn)詈俗冃曰颊哐邈~運(yùn)輸?shù)鞍住~藍(lán)蛋白(Caeruloplasmis)缺乏。盡管對(duì)它的確切意義不甚明了，但是此時(shí)人們已嘗試通過許多手段，例如高蛋白飲食、皮質(zhì)類固醇和鰲合劑乙二胺四醋酸(Ethylenediamine tetraacetic acid)來(lái)改善治療。事實(shí)上，上述治療措施沒有一個(gè)有好處。

1951 年，沃爾什(Walshe)教授進(jìn)入牛津大學(xué)醫(yī)學(xué)院登特教授的代謝研究所工作并引進(jìn)最新的紙色譜分析法(Paper chromatography)技術(shù)用于臨床生物化學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有肝病表現(xiàn)的WD患者存在氨基酸代謝紊亂。其主要觀察在肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma)部分肝切除(主要是左葉切除)期間患者的改變，他發(fā)現(xiàn)術(shù)后患者尿中排泄氨基酸，而這種情況術(shù)前從未發(fā)生過。這使人們自然而然地想到氨基酸移動(dòng)到溶解體系中，其與含硫氨基酸——半胱氨酸(Cysteine，也稱巰基丙氨酸)密切相關(guān)。沃爾什選用二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)作為溶解體系來(lái)研究氨基酸的移動(dòng)，他指出二甲基半胱氨酸是青霉素(Penicillin)的降解產(chǎn)物，人們習(xí)慣稱之為青霉胺。

根據(jù)這條線索，在術(shù)后他用青霉素治療患者時(shí)，特別注意觀察尿中是否出現(xiàn)氨基酸。不出所料，給予大劑量青霉素治療的患者，其尿中都出現(xiàn)氨基酸，最后他證實(shí)[12]：所有應(yīng)用青霉素治療的患者都出現(xiàn)上述情況。

不久以后沃爾什獲得富布萊特獎(jiǎng)學(xué)金到哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬的波士頓市醫(yī)院查爾斯·戴維森博士工作的肝病研究所進(jìn)修，他主攻肝昏迷時(shí)大腦的氧耗量和肝昏迷時(shí)出現(xiàn)在患者血循環(huán)中各種毒素的影響。有一次戴維森對(duì)進(jìn)行性肝功能衰竭的WD患者用二巰基丙醇處理，該患者有明顯的假性震顫(Pseudosclerotic tremor)和水潴留。很久以前，人們就認(rèn)識(shí)到青霉胺有特殊的分子結(jié)構(gòu)能鰲合銅，其在巰基和氨基之間與銅結(jié)合形成一個(gè)環(huán)狀復(fù)合物。戴維森博士有廣泛的交際圈，他通過他的人脈從馬薩諸塞州科技學(xué)院的約翰教授處獲得2 g青霉胺。然而這時(shí)新的問題凸現(xiàn)出來(lái)了，那就是青霉胺的安全治療劑量是多少？那個(gè)時(shí)代沒有倫理委員會(huì)，不需要征求誰(shuí)的許可。在實(shí)踐中，根本沒有哪個(gè)決定是建立在倫理指南之上的?；颊叻氯茉谒锏? g青霉胺24 h后未感覺任何不適，但是他們偶然發(fā)現(xiàn)：當(dāng)水加入青霉胺后它立即變?yōu)轷r藍(lán)色，這種非常意外的發(fā)現(xiàn)是由于巰基(-SH)和水中的鐵之間產(chǎn)生的顏色反應(yīng)，它似乎很安全。所以剩下的1 g青霉胺又給患者口服，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者尿中銅的排泄量明顯增加，但是依然沒有毒性反應(yīng)。事實(shí)上，不發(fā)生毒性反應(yīng)確實(shí)不足為奇。因?yàn)?，用青霉素治療的每個(gè)患者其尿中都有青霉胺排出。下一個(gè)問題是如何找到更多的青霉胺用于治療患者。這時(shí)戴維森的關(guān)系網(wǎng)再次發(fā)揮作用，他從默克公司的醫(yī)藥主管Sharp和Dohme處得到支持，他們同意在小鼠身上做一些簡(jiǎn)單的毒性試驗(yàn)并送5 g多的青霉胺給他。但是非常遺憾，當(dāng)把這些藥物給患者服用時(shí)，卻沒有排出銅尿，這時(shí)他們想起半胱氨酸(Cysteine，巰基丙氨酸)會(huì)自動(dòng)氧化為胱氨酸(Cystine，雙硫丙氨酸)而失去巰基(-SH)，青霉胺很可能也有同樣的反應(yīng)。根據(jù)這個(gè)推測(cè)，默克公司的醫(yī)藥主管做了一個(gè)試驗(yàn)，他用氯化鐵(Ferric chloride)做試驗(yàn)，結(jié)果沒有呈藍(lán)色，很明顯他所給戴維森的青霉胺已失去自由的巰基了，估計(jì)其中的二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)已自動(dòng)氧化成四甲基胱氨酸(Tetramethyl cystine)。在多次通信聯(lián)系后，默克公司的醫(yī)藥主管表示歉意并希望不能因?yàn)檫@失誤而影響WD的研究工作。非常幸運(yùn)，席漢教授幫助他們與Mann's精制化學(xué)藥品(Mann's Fine chemicals)公司聯(lián)系并從那里獲得50 g青霉胺，同時(shí)該公司提供使用說明書教會(huì)他們?nèi)绾芜M(jìn)一步做臨床試驗(yàn)。沃爾什進(jìn)修期滿后返回英國(guó)繼續(xù)上述研究，他發(fā)現(xiàn)從青霉素衍生而來(lái)的青霉胺是胺基酸的右旋異構(gòu)體(D-isomer of the aminoacid)，而合成的青霉胺是由胺基酸的右旋異構(gòu)體和左旋異構(gòu)體(L-isomer)組成，其中只有左旋異構(gòu)體有毒性。

隨后，沃爾什轉(zhuǎn)到劍橋大學(xué)工作并在醫(yī)學(xué)院的附屬醫(yī)院成立查爾斯·登特代謝研究所，他把青霉胺裝進(jìn)膠囊給WD患者服用，在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)他發(fā)現(xiàn)事情進(jìn)展很順利，因?yàn)榛颊呒炔辉儐杺惱韱栴}，也不考慮安全性，依從性相當(dāng)好?？偣灿?個(gè)患者接受治療，最初的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[13]：這種新藥治療的前景的確很好，它與其他的藥物不同，在單次治療量后所有患者都排出大量的銅。他們?cè)鴵?dān)心在長(zhǎng)期服用后可能會(huì)存在毒性，但所幸的是上述患者未發(fā)現(xiàn)任何問題。在試驗(yàn)后，二個(gè)患者繼續(xù)用二巰基丙醇(BAL)治療，其中一個(gè)患者不久后由于食管大出血而死亡，另一位患者數(shù)年后估計(jì)可能是由于效果不好或?qū)Χ€基丙醇不耐受而重新再用青霉胺。第一位接受青霉胺長(zhǎng)期治療的患者是一位女性，其用量是每天450 mg(現(xiàn)在認(rèn)為這個(gè)劑量太小)，在9個(gè)月后盡管某些癥狀及體征依舊，但她嚴(yán)重的震顫麻痹綜合征(Severe parkinsonian syndrome)開始得到改善，最后由于癥狀明顯好轉(zhuǎn)而得于成婚，婚后養(yǎng)育一個(gè)孩子。她50多歲后仍然繼續(xù)服用青霉胺，不過一直沒有明顯的副作用。

20世紀(jì)60年代后青霉胺被選作WD的治療藥物[14-17]。荷蘭神經(jīng)病學(xué)家Schouwink[18]的研究表明：鋅鹽(Zinc salts)可有效地抑制腸道銅的吸收，因此可用于WD的治療。然而，鋅不能促進(jìn)銅通過膽汁或尿液排泄，因此其降銅作用相當(dāng)緩慢。隨后荷蘭的Hoogenraad等[19]和美國(guó)的Brewer等[20]分別繼續(xù)研究鋅鹽療法，他們都是這一療法狂熱的支持者。最后，美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)僅同意鋅鹽在下述情況下使用：即先用鰲合劑降銅后，再用鋅鹽作為維持治療。與鰲合劑相比鋅鹽不但價(jià)格低廉，而且毒副作用小。假如把鋅鹽作為單一的治療，那么它的作用就相當(dāng)緩慢，它僅通過抑制腸道對(duì)銅的吸收而產(chǎn)生一種負(fù)銅平衡。Hoogenraad[21]和Brewer[22]于20世紀(jì)末曾經(jīng)就鋅鹽這種療法誰(shuí)最先發(fā)現(xiàn)的問題公開論戰(zhàn)，但事實(shí)上Schouwink[18]于1961年已做初步研究，他才是真正的功勛級(jí)人物。有關(guān)青霉胺毒副作用的報(bào)道不少[23-24]，其中最嚴(yán)重的是免疫反應(yīng)導(dǎo)致系統(tǒng)性紅斑狼瘡和免疫復(fù)合物性腎炎。雖然這些毒副作用不多見，但它使青霉胺的臨床應(yīng)用備受爭(zhēng)議[25-26]。事實(shí)上，在這個(gè)問題上真是“仁者見仁，智者見智”。如果用青霉胺連續(xù)治療患者，那么他(她)有可能會(huì)因青霉胺腎病而導(dǎo)致腎衰竭死亡。但是，如果停用藥物，那么他(她)也可以會(huì)因肝豆?fàn)詈俗冃缘陌Y狀而夭折。二巰基丙醇(BAL)只產(chǎn)生輕度的銅尿，但它可帶來(lái)巨大的麻煩，因此，臨床上摒棄它，不作為WD治療的選擇。

尋找新的鰲合劑已成為當(dāng)務(wù)之急，理想中的鰲合劑應(yīng)符合如下標(biāo)準(zhǔn)：(1)沒有毒性；(2)可以口服；(3)其從尿中排泄銅的作用應(yīng)不亞于青霉胺。用老鼠做實(shí)驗(yàn)研究多少有點(diǎn)不科學(xué)，許多復(fù)合物從結(jié)構(gòu)上看很有希望成為理想中的鰲合劑，但實(shí)際應(yīng)用沒有一個(gè)有效果。沃爾什就此事專門請(qǐng)教生物化學(xué)教授狄克遜，后者建議使用三乙烯毒鼠強(qiáng)(Triethylene tetramine，也稱三乙烯羥化四甲胺)，他指出三乙烯毒鼠強(qiáng)在生物化學(xué)上具有產(chǎn)生胺、精胺(Spermine)和亞精胺(Spermidine)的類似結(jié)構(gòu)，因此經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后可沒有毒性。眾所周知，三乙烯毒鼠強(qiáng)是工業(yè)化學(xué)品，習(xí)慣上用作環(huán)氧樹脂硬化劑(Epoxyresin hardener)，它是一種強(qiáng)堿，pH值為14。因此，要通過中和作用把pH值降至7.2左右。由于它是商用化學(xué)品，其純度僅在60%以下，所以要用于臨床就必須生產(chǎn)出一種純潔的結(jié)晶鹽。事實(shí)上，要生產(chǎn)出純潔的產(chǎn)品相當(dāng)困難，先通過生成二鹽酸化合物(Dihydrochloride)提高純度，最后經(jīng)過冷凍干燥(Freeze drying)把雜質(zhì)除去。這種產(chǎn)品極容易潮濕，它必須儲(chǔ)存在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide)的環(huán)境。它的味道相當(dāng)像無(wú)味的餅干，當(dāng)把這種藥給老鼠服用時(shí)，發(fā)現(xiàn)它無(wú)毒并能引起明顯的銅尿。時(shí)光倒流到當(dāng)時(shí)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，當(dāng)單劑量給有WD腎病的患者服用時(shí)，發(fā)現(xiàn)患者排出大量的銅尿，并明顯提示該藥對(duì)WD的治療具有良好的前錦[27-28]。若干年后，隨著粗制的三乙烯羥化四甲胺治療青霉胺不耐受患者數(shù)量的增加，越來(lái)越證明它是有價(jià)值的[29]。沃爾什的助手對(duì)該藥進(jìn)行有效負(fù)荷試驗(yàn)，他們把藥物裝進(jìn)膠囊分給患者服用，這種自我負(fù)責(zé)的藥理學(xué)冒險(xiǎn)行為不可避免地終于遇到麻煩。2例對(duì)青霉胺發(fā)生早期毒性反應(yīng)的新患者改用從新的供應(yīng)商那里購(gòu)買來(lái)的粗制三乙烯羥化四甲胺時(shí)，全部發(fā)生急性腎小管壞死。這次治療立即被“叫?！?。此時(shí)，他們從這批三乙烯羥化四甲胺中尋找有毒的雜質(zhì)，曾疑及三氨乙基胺(Triaminotriethylamine)，但它又不象導(dǎo)致事故的罪魁禍?zhǔn)?。因?yàn)楦髋蔚娜蚁┝u化四甲胺中都會(huì)有三氨乙基胺，并已用數(shù)年，但已往未見類似情況發(fā)生。藥理學(xué)系的Grundy教授研究發(fā)現(xiàn)三氨乙基胺的分子式有可能是一種神經(jīng)節(jié)阻滯劑，最后證實(shí)這種推論是正確的。隨后不久，Hal Dixon采用一種十分完美的方法經(jīng)過結(jié)晶化從無(wú)水酒精(Absolute alcohol)中提純?nèi)蚁┝u化四甲胺(Triethylene tetramine)，緊接著他們用這種純化的藥品治療患者，結(jié)果表明患者可以耐受。幾周后接受治療的患者病情得到明顯的改善，正當(dāng)她準(zhǔn)備出院時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)已懷孕，這次懷孕是由于幾周前她丈夫來(lái)醫(yī)院探病時(shí)發(fā)生的?，F(xiàn)在問題出現(xiàn)了：那種三乙烯羥化四甲胺對(duì)胎兒有影響嗎？主管醫(yī)生Hilda Bruce立即用老鼠做了一些初步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示這種藥沒有致畸作用。非常幸運(yùn)，妊娠很成功，足月后她產(chǎn)出一個(gè)正常的男嬰。

Addenbrooke's醫(yī)院藥房能接受在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生產(chǎn)高純度的三乙烯羥化四甲胺用于治療患者是一件勇敢的決定。要知道在今天沒有政府的授權(quán)那是不可能的。然而，這樣的藥品來(lái)源只是杯水車薪，它不能最終解決藥品供應(yīng)的長(zhǎng)期問題。就此事在劍橋(Cambridge)召開了一個(gè)專家會(huì)議，專題討論罕見病的藥用問題。參會(huì)人員有制藥行業(yè)的代表、醫(yī)療失當(dāng)保險(xiǎn)公司、醫(yī)學(xué)倫理學(xué)專家、感興趣的醫(yī)生和衛(wèi)生部門。這個(gè)長(zhǎng)期困擾臨床工作者的問題最終獲得解決，衛(wèi)生部門同意掌管產(chǎn)品許可證并由政府的化學(xué)家負(fù)責(zé)把關(guān)廠家提供臨床使用的三乙烯羥化四甲胺二氫氯化合物(Triethylene-tetramine-2-hydrochloride)的純度。一家名叫寒武紀(jì)的化學(xué)藥品子公司對(duì)生產(chǎn)這種藥表現(xiàn)出很濃的興趣，同意成為官方的供應(yīng)商。在第一次臨床使用15年以后，這個(gè)化合物終于獲得政府正式的生產(chǎn)許可，并將商品名定為曲恩汀(Trientine)。似乎采用3種療法——青霉胺、鋅鹽和曲恩汀就可以完全征服WD，其實(shí)不然，在人類攻克WD的漫漫長(zhǎng)途中，到處布滿荊棘和坎坷，一個(gè)問題解決了，又會(huì)冒出新的問題。早在1980年，一位16歲的女孩出現(xiàn)輕微的肌張力失常，她的家庭醫(yī)生非常機(jī)敏，立即想到她可能罹患WD。因?yàn)?，最近她的姐姐由于患了一種未確診的神經(jīng)綜合征而死于倫敦一家醫(yī)院。事實(shí)上，這位醫(yī)生診斷非常正確，但所不幸的是她在剛開始用青霉胺治療后便出現(xiàn)免疫反應(yīng)(溶血性貧血)，隨后改用曲恩汀治療又發(fā)生免疫復(fù)合物腎炎。迫于無(wú)奈她只能停用上述兩藥而改服硫酸鋅，在服藥一年后她的臨床情況還算平穩(wěn)，但仍然有輕度的肌張力失常。她的肝活檢提示有組織學(xué)惡化和肝銅含量飆升。她曾嘗試用二巰基丙醇(BAL)，但很快又因?yàn)樗幬锓磻?yīng)而出現(xiàn)頑固性高熱。顯然，對(duì)于這種患者已沒有切實(shí)可行的治療方案了。因此，尋找新的藥物治療已成為迫在眉睫的事情。眾所周知，從事獸醫(yī)工作的人都深深懂得，當(dāng)牧場(chǎng)的牧草被鉬污染后羊便會(huì)出現(xiàn)缺銅。1957年，Bickel等[30]根據(jù)上述事實(shí)嘗試用鉬酸鹽(Molybdate)作為一個(gè)抗銅藥使用。但是，在研究過程中他們發(fā)現(xiàn)鉬酸鹽在臨床和生物化學(xué)上都不存在好處，造成這種誤解是他們不認(rèn)識(shí)到影響羊缺銅的另外的因素是富硫的牧草和皺胃(Abomasum，羊的第二胃，反芻動(dòng)物胃的第四部分)內(nèi)的還原，在那里鉬酸鹽被分解成四硫鉬酸鹽(Tetrathiomolybdate)，后者才是一種作用強(qiáng)的抗銅因子。四硫鉬酸鹽的純化問題由萊斯特市蒙特福特大學(xué)(Montfort University)無(wú)機(jī)生物化學(xué)家斯圖爾特·勞里(Stuart Laurie)教授解決。由于缺乏這種復(fù)合物在人體使用的毒性資料[31]，所以在別無(wú)選擇的情況下，沃爾什在臨床使用前自己服用4 d，經(jīng)觀察未發(fā)現(xiàn)臨床和生物化學(xué)的毒性證據(jù)。勞里教授建議每天2次，每次30 mg服用。出乎意料的是：用藥后患者血清銅含量明顯增加，但尿銅僅輕度增多，血清銅在三氯乙酸(Trichloracetic acid)的可溶部分降低，這提示銅已經(jīng)與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合。用放射性銅(Radioactive copper)研究表明：與服藥前相比，服藥后同位素銅越來(lái)越多地從血漿中緩慢地被清除。當(dāng)口服放射性銅時(shí)，發(fā)現(xiàn)用四硫鉬酸鹽的患者幾乎沒有從腸道吸收銅，在這方面它的作用比鋅鹽更加有效[32]。用四硫鉬酸鹽治療一年后，患者肝臟組織學(xué)完全恢復(fù)正常，血銅濃度降至治療前的1/3，它與患者的臨床癥狀、體征的改善完全一致。顯然，這是一種有效的新療法。然而，藥源匱乏及價(jià)格昂貴依然困擾著患者。

20世紀(jì)80年代WD在治療學(xué)上的另一個(gè)進(jìn)展是：Scheinberg等[33]重新發(fā)現(xiàn)二巰基丙醇(BAL)的應(yīng)用。他們發(fā)現(xiàn)對(duì)于一些嚴(yán)重的肌張力障礙患者，該藥可促進(jìn)癥狀的緩解。Yonetani等[24]也發(fā)現(xiàn)，對(duì)少數(shù)WD患者添加二巰基丙醇治療非常有效。該藥是一種較好的脂溶性和非極性(Non-polar)復(fù)合物，對(duì)一些患者來(lái)說二巰基丙醇更容易透過血腦屏障(Blood-brain barrier)。不得不承認(rèn)的是，現(xiàn)在依然有少數(shù)患者對(duì)任何治療都沒有效，其中的原因尚不清楚，據(jù)估計(jì)可能與臨床表型的異質(zhì)性有關(guān)。迄今為止，雖然WD的基因突變只有400多種，但是雜合子的排列組合的數(shù)目是巨大的。

2 病因和發(fā)病機(jī)理

2.1 正常銅的代謝及功用正常人體內(nèi)含銅100～200 mg，其中大部分分布或貯存于不同組織的蛋白質(zhì)和血液中，以肝和腦的含量最高，各占總量的10%。肝臟是銅代謝的中心。正常人每日從飲食中攝入銅2.5～4 mg，主要通過胃、十二指腸和空腸上端吸收。入血的銅通過位于腸細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(Transporter protein)-ATP7A的作用然后經(jīng)門靜脈進(jìn)入血循環(huán)，再通過位于肝細(xì)胞竇狀隙面的銅轉(zhuǎn)運(yùn)體(CTRI)進(jìn)入肝細(xì)胞。進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)的銅分為三部分：一部分參與銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，CP)的合成；一部分結(jié)合到細(xì)胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶等重要的銅蛋白；另一部分分泌入膽小管經(jīng)膽道直接排出體外。機(jī)體中許多酶含有銅，銅在機(jī)體的新陳代謝中起著各種各樣的作用。如在細(xì)胞色素C氧化酶中，銅起著輔助因子(Co-factor)的作用，在生理狀態(tài)下接受和傳遞電子[34]；成纖維細(xì)胞生成因子1(Fibroblast growth factor1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-1α(IL-1α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的釋放離不開銅；在生物學(xué)上，活化的細(xì)胞外多肽(Extracellular polypeptides)參與炎癥過程需要依賴銅的存在；在細(xì)胞培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞或巨噬細(xì)胞依賴因子誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的增生，銅是必不可少的[35-37]。在血管再生通路(Angiogenesis pathway)的許多環(huán)節(jié)中銅也起著關(guān)鍵作用[38-39]。

2.1.1 ATP7B蛋白(WD蛋白)ATP7B蛋白是一種銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶，僅在肝細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，在肝內(nèi)對(duì)銅離子有吸收和分泌的二重作用。當(dāng)肝細(xì)胞低銅時(shí)，ATP7B移動(dòng)到高爾基體內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將銅離子轉(zhuǎn)入高爾基體；當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)銅過量時(shí)，ATP7B移向肝細(xì)胞的小管面，將銅離子分泌入膽道使銅排出。

2.1.2 銅藍(lán)蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能銅藍(lán)蛋白基因位于3q23～25，由21個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)約45 kb，它所表達(dá)的銅藍(lán)蛋白是一個(gè)132 kD的糖蛋白，屬α2球蛋白。銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin，CP)大部分與銅離子結(jié)合形成6個(gè)銅離子的蛋白，稱為全銅藍(lán)蛋白(HOIO-CP)，少部分銅藍(lán)蛋白不與銅結(jié)合，稱為脫銅藍(lán)蛋白(APO-CP)。銅藍(lán)蛋白從肝細(xì)胞釋放入血，它具有如下功能：①銅藍(lán)蛋白是血中銅的主要攜帶者，負(fù)責(zé)攜帶血中90%～95%的循環(huán)銅，并作為銅的供體參與細(xì)胞色素C氧化酶和其含銅酶的合成；②具有亞鐵氧化酶的作用，能氧化亞鐵為高鐵，同時(shí)使氧還原成水；③具有多酚氧化酶的作用，能氧化芳香二胺、兒茶酚胺、5-羥色胺、褐黑色素及維生素C等。

2.2 WD分子發(fā)病機(jī)制

2.2.1 WD基因的定位及克隆1989年WD基因被準(zhǔn)確定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。WD基因編碼的蛋白稱為ATP7B酶或ATP7B蛋白或WD蛋白，該基因在肝、腎、胎盤高度表達(dá)，編碼一個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶，這是一種銅依賴性P型ATP酶。

2.2.2 WD基因的結(jié)構(gòu)及特征WD基因長(zhǎng)約80 kb，含有21個(gè)外顯子(Exon)及20個(gè)內(nèi)含子(in-tron)。WD基因是由1411個(gè)氨基酸組成的銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型-ATP酶(P-type ATPase，ATP7B)。WD蛋白主要有三個(gè)功能區(qū)：①金屬離子結(jié)合區(qū)；②P型ATP酶功能區(qū)(也稱高度保守區(qū))；③跨膜區(qū)(也稱疏水區(qū))。

2.2.3 WD的發(fā)病機(jī)制WD的發(fā)生主要是由于WD基因發(fā)生突變，其編碼的P型ATP酶(ATP7B)發(fā)生了功能改變，若其功能部分或全部喪失，就會(huì)發(fā)生兩種情況：①ATP7B不能和脫銅藍(lán)蛋白(APO-CP)結(jié)合轉(zhuǎn)化為銅藍(lán)蛋白(CP)，其結(jié)果是患者血清銅藍(lán)蛋白減少；②ATP7B不能將多余的銅離子分泌入膽道而排出體外，結(jié)果銅離子在肝細(xì)胞內(nèi)沉積產(chǎn)生銅毒，過量的銅損害肝細(xì)胞的線粒體，產(chǎn)生過氧化損傷。另外，銅離子從肝細(xì)胞溢出進(jìn)入血液，使體內(nèi)其他器官如腦、腎、血細(xì)胞等的銅過度負(fù)荷并發(fā)生銅中毒。

2.3 WD基因的突變迄今為止，已報(bào)道的WD基因突變位點(diǎn)達(dá)400多個(gè)。世界上不同的地域或民族存在不同的WD基因突變熱點(diǎn)。因此，基因檢測(cè)位點(diǎn)的選擇要注意種族特異性和針對(duì)性，避免無(wú)的放矢。一般說來(lái)，在歐美患者中，WD基因的高頻突變點(diǎn)是14號(hào)外顯子His1069Gln(H1069Q)，它位于WD基因的ATP結(jié)合區(qū)，突變改變了ATP蛋白上的ATP環(huán)，導(dǎo)致蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，從而影響其結(jié)合能力。而我國(guó)WD患者的高頻突變點(diǎn)是8號(hào)外顯子Arg778Leu(A778L)，此突變位于第4跨膜區(qū)，突變減弱了銅的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.4 WD與細(xì)胞因子的關(guān)系業(yè)已證明神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦缺血、癲癇、腦外傷、多發(fā)性硬化、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病和帕金森病時(shí)血清細(xì)胞因子含量增加，然而，它們?cè)谏窠?jīng)系統(tǒng)疾病病理生理學(xué)中的確定作用依然尚未明了[40]。在WD的病理生理學(xué)研究中，盡管人們一直深信患者各種組織內(nèi)自由銅含量的增加可導(dǎo)致自由基的損傷。但是，以往的研究未發(fā)現(xiàn)WD患者的血清丙二醛(Malondialdehyde)含量明顯高于對(duì)照組[41]。有關(guān)細(xì)胞因子在WD中作用的文獻(xiàn)資料相當(dāng)匱乏，所以說銅沉積導(dǎo)致組織損傷的機(jī)制在很大程度上依然是一個(gè)懸而未決的問題。基于上述情況有學(xué)者提出一種假說[42]，那就是：在WD的發(fā)病機(jī)制中銅引起細(xì)胞因子含量增高可能起著重要作用，臨床上可通過藥物減少組織銅的含量來(lái)降低血清細(xì)胞因子的濃度，從而減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷。Goyal等[43]就上述問題進(jìn)行了相關(guān)的研究。具體方法：通過比較未用藥患者和使用去銅治療患者血清各種細(xì)胞因子如白介素-2 (IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、r-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：WD患者血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α，P＜0. 001)、γ-干擾素(IFN-γ，P=0.005)、白介素-6(IL-6， P＜0.001)含量升高，并且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異，而血清白介素-4(IL-4，P=0.49)和白介素-2(IL-2，P=0.11)的含量與對(duì)照組之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不存在差異。

3 WD的病理學(xué)改變

3.1 肝臟光鏡下可見肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，胞核呈空泡狀。最早期的肝細(xì)胞改變只能在電鏡下發(fā)現(xiàn)。Dickersin對(duì)早期WD(無(wú)癥狀)的肝臟病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：①線粒體增大、多形性，伴基質(zhì)密度增高；②過氧化小體數(shù)目增多、體積增大、多形性；③滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡形成；④三酰甘油空泡增加；⑤溶酶體內(nèi)脂滴和銅沉積。Lecca等對(duì)74例WD患者的肝活檢標(biāo)本進(jìn)行研究，將其病理改變從輕到重分為肝脂肪變性期、肝炎期、肝纖維變性期和肝硬化等4期。病程進(jìn)展快者可呈亞急性黃色肝萎縮。光鏡下可見肝臟假小葉外周肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有銅樣(褐色顆粒狀)沉積物。肝硬化期較有特征性的改變是出現(xiàn)馬洛里小體(Mallory body)。

3.2 脾臟腫大，包膜增厚，光鏡下見脾竇高度充血，脾包膜及小梁結(jié)締組織增生，細(xì)胞內(nèi)有許多細(xì)小的棕黃色顆粒(銅樣物)。

3.3 腦部病變主要在基底節(jié)，以殼核最明顯，次為蒼白球及尾狀核。其他如大腦皮質(zhì)、丘腦、紅核、黑質(zhì)、齒狀核、中腦、腦橋、小腦均可受累。殼核皺縮，嚴(yán)重者形成空洞。光鏡見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生及膠質(zhì)小結(jié)形成和水腫。電鏡下見豆?fàn)詈松窠?jīng)細(xì)胞呈變性壞死，細(xì)胞質(zhì)膜斷裂，毛細(xì)血管基底膜電子密度明顯增高。

3.4 腎臟電鏡下見腎曲管上皮細(xì)胞間隙明顯增大，細(xì)胞連接減少，部分微絨毛彎曲呈分支狀，出現(xiàn)融合現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少。

4 WD的臨床表現(xiàn)

4.1 分期(1)癥狀前期：銅在肝、腦、腎、角膜等器官逐漸沉積，而無(wú)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)；(2)癥狀期：由于銅的毒性作用而出現(xiàn)各種臨床表現(xiàn)；(3)恢復(fù)期：經(jīng)過治療，癥狀獲得部分或完全緩解；(4)穩(wěn)定期：癥狀穩(wěn)定，24 h尿銅水平較為穩(wěn)定。

4.2 起病年齡及形式本病發(fā)病年齡多在5～55歲，3歲及72歲均有。起病多屬緩慢，在典型的臨床表現(xiàn)之前有一個(gè)前驅(qū)期，這期間銅累積在肝臟引起亞臨床肝炎，隨后發(fā)展為慢性間質(zhì)性肝炎和發(fā)生神經(jīng)精神癥狀。肝臟和神經(jīng)癥狀千差萬(wàn)別。WD有時(shí)表現(xiàn)為：庫(kù)姆氏陰性溶血性貧血(Coombs-negative haemolytic)，暴發(fā)性肝功能衰竭(Fulminant hepatic failure)和急性腎功能衰竭。

4.3 首發(fā)癥狀患者出生后即存在銅代謝障礙，5～10歲時(shí)肝內(nèi)的銅處于飽和狀態(tài)。一般說來(lái)兒科患者以肝病癥狀起病多見，形式多樣化，可表現(xiàn)為急性或慢性肝炎，也有以暴發(fā)性肝炎表現(xiàn)發(fā)病者[44]。

4.4 肝病癥狀本病的病理生理過程是大量的銅首先堆積在肝臟，然后沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、角膜、腎和其他器官，因而肝臟是本病最主要也是最早受累的靶器官。大約80%患者發(fā)生肝臟癥狀。兒童患者開始常出現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)升高和非特異性慢性肝損害癥狀，如倦怠、乏力、食欲不振及發(fā)熱等，以后可漸出現(xiàn)肝區(qū)痛、肝大、黃疸、蜘蛛痣、脾大、脾功能亢進(jìn)、食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水和特發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎等進(jìn)行性壞死后性肝硬化癥狀。慢性活動(dòng)性肝炎發(fā)生于10%～30%的WD患者。

4.5 神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生率93%～97%，由銅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過量沉積造成。其主要在基底節(jié)沉積，臨床上突出表現(xiàn)是錐體外系病征。最早、最常見的癥狀是肢體震顫，多是單側(cè)肢體尤以上肢先出現(xiàn)，可呈靜止性、意向性或姿勢(shì)性震顫，往往是幾種震顫形式混合出現(xiàn)，震顫幅度可為細(xì)小或粗大，當(dāng)震顫以上肢近端明顯時(shí)，形成所謂“撲翼樣震顫”。隨病情進(jìn)展，四肢、頭顱、下頜等均可見震顫。構(gòu)音障礙也是常見癥狀，由于咽喉、舌及面部肌肉強(qiáng)直所致，患者講話緩慢，聲音低沉含糊且無(wú)變化，斷斷續(xù)續(xù)，嚴(yán)重時(shí)不出聲。流涎和吞咽困難很常見，重者不能吞咽，這是因咽喉肌肉和吞咽肌肉發(fā)生肌強(qiáng)直所致。肌張力障礙累及面部及口部肌肉時(shí)引起面具樣臉、苦笑貌、怪異表情或口面部不自主運(yùn)動(dòng)。肌強(qiáng)直累及肢體及軀干時(shí)產(chǎn)生肢體強(qiáng)硬、動(dòng)作緩慢、轉(zhuǎn)變姿勢(shì)困難等。不少患者因肢體強(qiáng)直、攣縮導(dǎo)致畸形。步態(tài)異常也普遍存在，表現(xiàn)為起步困難、拖曳而行，走路向兩側(cè)搖擺，或出現(xiàn)類似帕金森病的慌張步態(tài)。其他的錐體外系癥狀還有舞蹈動(dòng)作、手足徐動(dòng)等。另外常見癥狀如小腦損害導(dǎo)致共濟(jì)失調(diào)、小腦性語(yǔ)言障礙、皮質(zhì)功能損害引起進(jìn)行性智力減退；下丘腦損害可產(chǎn)生肥胖、持續(xù)高熱、高血壓、發(fā)作性昏迷等。

4.6 精神癥狀10%～51%的患者發(fā)生精神癥狀，約20%患者曾在確診WD之前按各種精神病治療。精神癥狀主要表現(xiàn)為情感障礙，如冷漠、抑郁、欣快、興奮躁動(dòng)、恐懼、強(qiáng)哭強(qiáng)笑等。動(dòng)作及行為異常，如幼稚動(dòng)作、怪異行為、生活懶散、喃喃自語(yǔ)、攻擊行為、違拗，少數(shù)患者有自殺行為。部分患者有各種妄想、思維遲鈍、幻覺、人格改變。不少患者有認(rèn)知功能障礙。WD患者的精神癥狀有時(shí)持續(xù)很久，雖經(jīng)驅(qū)銅治療也無(wú)明顯效果，晚期可有癡呆。

4.7 角膜色素環(huán)(Kayser-Fleischer環(huán)，K-F環(huán))角膜K-F環(huán)最早由德國(guó)眼科專家Kayser(1902)和Fleischer(1903)分別報(bào)道而得名，被公認(rèn)為WD的特征性臨床改變[45]。K-F環(huán)是由于銅沉積于角膜后彈力層所致。絕大多數(shù)見于雙眼，個(gè)別見于單眼，此環(huán)寬約1.3 mm，多呈黃棕色或黃綠色，有時(shí)是雙環(huán)。K-F環(huán)明顯時(shí)用電筒式放大鏡可窺及，但早期常須借助裂隙燈始能發(fā)現(xiàn)。嬰幼兒患者不容易發(fā)現(xiàn)此環(huán)，但隨著年齡增長(zhǎng)，角膜后沉積的銅離子越來(lái)越多，K-F環(huán)才明顯。K-F環(huán)明顯與否和病情輕重、治療效果不一定相關(guān)。

4.8 腎臟癥狀銅在腎臟沉積主要損害近端腎小管，因腎小管重吸收功能障礙，出現(xiàn)腎性糖尿、氨基酸尿、磷酸鹽尿、尿酸尿、高尿鈣、蛋白尿和腎鈣質(zhì)沉積癥。鏡下輕度血尿較常見。此外，部分患者還可發(fā)生腎小管性酸中毒。

4.9 血液系統(tǒng)癥狀有些患者以急性溶血危象起病，這可能是由于患者肝細(xì)胞內(nèi)的銅向溶酶體轉(zhuǎn)移的速度過快，引起溶酶體損害，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，大量的銅從壞死的肝細(xì)胞中釋出，進(jìn)入血液，破壞紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生嚴(yán)重的Coomb's陰性溶血性貧血，其死亡率相當(dāng)高。此外，鼻出血，牙齦出血及皮下出血等常見。

4.10 肌肉骨骼癥狀WD患者的骨骼及肌肉損害不少見，肌肉癥狀主要表現(xiàn)為肌無(wú)力、肌痛、肌萎縮。骨質(zhì)疏松見于2/3的患者，其他如骨及軟骨變性、關(guān)節(jié)畸形、X型腿、自發(fā)性骨折、腎性佝僂病等也可發(fā)生。四肢關(guān)節(jié)均可發(fā)生病變，尤以膝關(guān)節(jié)多見，常有關(guān)節(jié)疼痛及僵硬，易誤診為風(fēng)濕性或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

4.11 眼部癥狀WD患者除了具有特征性的K-F環(huán)外，約17%的患者出現(xiàn)白內(nèi)障，特征是向日葵樣分布，主要由于銅在晶體沉積所致。此外，還有暗適應(yīng)能力下降、外斜視、集合力不足、瞳孔反應(yīng)遲鈍及調(diào)節(jié)減弱等。

4.12 其他癥狀部分患者皮膚色素沉著，皮膚較黑，尤以面部及雙小腿外側(cè)明顯，當(dāng)癥狀好轉(zhuǎn)時(shí)可見色素沉著減輕，皮膚轉(zhuǎn)白。此外，WD患者有時(shí)尚有心律失常、心電圖異常、葡萄糖耐量異常及甲狀腺功能低下等。

4.13 兒童WD的臨床特點(diǎn)患兒3歲即可起病，以7～12歲多見。約占半數(shù)以上的患兒以肝病癥狀開始。年齡越小，以肝病癥狀起病越多，臨床上可表現(xiàn)為急性或慢性肝炎的過程，也有以暴發(fā)性肝炎表現(xiàn)發(fā)病者，常常被誤診為病毒性肝炎，主要癥狀為食欲不振、疲乏、嗜睡、黃疸及腹痛等，體征表現(xiàn)為肝脾腫大、肝區(qū)疼痛和浮腫等，可出現(xiàn)脾大、腹水、出血傾向、食道靜脈曲張等肝硬化表現(xiàn)，偶可見急性或亞急性黃色肝萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重肝功能衰竭，可在數(shù)周內(nèi)死亡。約20%以神經(jīng)系統(tǒng)異常為首發(fā)癥狀，一般說來(lái)，神經(jīng)、精神癥狀以較大兒童多見，多在肝病癥狀數(shù)月、數(shù)年后出現(xiàn)。主要表現(xiàn)為錐體外系癥狀，常見肌張力不全、步態(tài)異常、軀干扭轉(zhuǎn)痙攣、構(gòu)音障礙、吞咽困難、流涎、表情呆板、肢體震顫，也可有行為改變和學(xué)習(xí)困難。年長(zhǎng)兒有時(shí)可有抑郁、人格改變或精神分裂癥樣表現(xiàn)，個(gè)別有小腦共濟(jì)失調(diào)、癲癇、輕偏癱及錐體束征等，年幼兒K-F環(huán)多為陰性。(待續(xù))

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1003—6350（2013）06—0892—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.06.0383

2013-01-24)

楊健。E-mail：wenxiaomei0898@126.com