遺傳性對稱性色素異常癥一個(gè)家系DSRAD基因突變分析

易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龍崗區(qū)橫崗人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳518115)

遺傳性對稱性色素異常癥一個(gè)家系DSRAD基因突變分析

易恒安，李敏，邱玉芬

(深圳市龍崗區(qū)橫崗人民醫(yī)院皮膚科，廣東深圳518115)

目的對遺傳性對稱性色素異常癥一個(gè)家系DSRAD基因突變進(jìn)行檢測，以期尋找到新的致病突變。方法收集一患有遺傳性對稱性色素異常癥家系，該家系除了有典型的皮疹外，身體發(fā)育、智力均正常，五官科及內(nèi)科檢查正常，無明顯的系統(tǒng)癥狀，采用RT-PCR方法從人外周血中獲得DSRAD基因cDNA，并篩選出合適的基因序列與人類基因庫中的相應(yīng)基因進(jìn)行對比分析，找出可疑的位點(diǎn)，并通過單鏈構(gòu)象技術(shù)對新突變進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果該家族DSRAD基因序列的測定結(jié)果證實(shí)患者染色體中存在堿基替換的情況，患者堿基由Q389Q替換為A1167G，患者編碼氨基酸并沒有發(fā)生改變，仍然為谷氨基酸，屬于同義突變?；颊逥NA經(jīng)單鏈構(gòu)象分析證實(shí)為同一家族的基因，在家族健康人及非血緣關(guān)系的人群中未發(fā)現(xiàn)編碼基因。結(jié)論患者皮膚色素出現(xiàn)異常的改變可能與患者基因出現(xiàn)同義突變有關(guān)，但目前該突變機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入分析。

遺傳性；對稱性；色素；DSRAD基因；突變

遺傳性對稱性色素異常癥(DSH)屬于人類常染色體中顯性基因異常的疾病，其外顯率較高，目前改病的發(fā)生機(jī)理尚不明確。近年來國內(nèi)外已有相關(guān)的遺傳學(xué)家對其致病機(jī)理從遺傳學(xué)的角度進(jìn)行研究，并確定了該疾病的出現(xiàn)是由于患者體內(nèi)雙鏈RNA上的DSRAD出現(xiàn)突變引起的[1]。目前相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)在DSH患者中存在著40多處這種突變。為了更深入了解患者DSRAD突變過程，本文對DSH家族中存在的DSRAD基因突變進(jìn)行檢測確認(rèn)，并對DSRAD突變對皮膚代謝產(chǎn)生的作用進(jìn)行分析，現(xiàn)分析結(jié)果如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料于2012年1～6月選取DSH疾病家系中3代的人群為研究對象，共12人，其中患者6例，先證者是15歲的女性，患者智力、體格發(fā)育與同齡人無疑，不存在系統(tǒng)性疾病?；颊?歲開始表現(xiàn)在手背部出現(xiàn)色素減退的現(xiàn)象，隨著患者年齡的增長，其色素退斑現(xiàn)象變得顯著，同時(shí)伴有皮損蔓延及色素沉著斑點(diǎn)的現(xiàn)象。目前患者病情已經(jīng)發(fā)展至右腳踝及侵入到手背部，皮損現(xiàn)象在夏季尤為明顯，冬季病情減輕。隨著年齡的增加，其色素沉著現(xiàn)象顯著，皮損出現(xiàn)蔓延。先證者的母親從2歲開始初見皮損，隨著年齡增加，皮損顯著明顯，色素沉著情況嚴(yán)重，面部出現(xiàn)雀斑?；颊呔司艘渤霈F(xiàn)類似的癥狀，患者四肢出現(xiàn)深淺不一的色素減退斑，其臨床癥狀符合DSH，但患者皮膚、毛發(fā)及牙齒均表現(xiàn)正常。

1.2 方法(1)DNA提取：采用改良鹽析法提取基因組DNA；該方法操作步驟簡單，DNA損失少，獲取率高，而且該法所用的試劑價(jià)格便宜，性質(zhì)穩(wěn)定，不需特殊實(shí)驗(yàn)條件及蛋白酶K，所得DNA純度高。(2)基因組mRNA的提?。翰杉劝Y者與一名正常家系成員靜脈血5 ml以提取mRNA。(3)RT-PCR獲取cDNA。(4)設(shè)計(jì)DSRAD基因的引物：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和GenBank中公布的人DSRAD基因的cDNA序列，通過Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。由于DSRAD基因的CDS區(qū)有3 680多個(gè)堿基，所以擬設(shè)計(jì)3對PCR特異性引物擴(kuò)增該基因全長。(5)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：由“變性——退火——延伸”三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。(6)切膠回收特異性目的條帶：在紫外光下用干凈鋒利的刀片切下瓊脂糖凝膠中的目的片段并進(jìn)行回收。(7)連接：回收的目的片段DNA與pTA2載體進(jìn)行鏈接。(8)制備感受態(tài)細(xì)菌DH5α。(9)轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化后涂布于含有Amp，X-gal和IPTG的LB平板上于37℃培養(yǎng)箱過夜。(10)陽性克隆鑒定：隨機(jī)挑取約5個(gè)白色菌落以DSRAD引物進(jìn)行菌落PCR，鑒定出目的基因的陽性克隆。(11)DSRAD的序列測定與分析：將經(jīng)過鑒定的陽性克隆生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果通過BLAST程序網(wǎng)上比對找出可能的突變位點(diǎn)。(12)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析。(13)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。(14)銀染。

2 結(jié)果

采用PCR擴(kuò)增法克隆DARAD后與BLAST比對，發(fā)現(xiàn)在DSRAD中第1167位點(diǎn)的堿基中存在著可疑的突變，堿基上的起始密碼ATG中的A突變?yōu)镚，從而引起399位的CAA密碼子轉(zhuǎn)化為CAG，但編碼的氨基酸種類并沒有發(fā)生改變，仍然為谷氨酰胺。通過SSCP分析獲知患者染色體存在異常，而在正常的家族成員及非血緣關(guān)系的人群中不存在此情況。

3 討論

DSH是屬于常染色體的顯性突變，因此在患病者家族中表現(xiàn)的是顯性病癥[2]。高敏等在2003年時(shí)對該病進(jìn)行了相應(yīng)的研究，將致病基因定位在1號常染色體11.6厘摩爾的區(qū)域內(nèi)，Miyamura等認(rèn)為該病的突變位點(diǎn)是在該區(qū)間的DSRAD區(qū)域內(nèi)，該基因?qū)儆贏DAR族的成員[3]。ADAR基因廣泛存在于自然界各種生物中，其生物學(xué)功能是能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯及對RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。該基因段全長為30 kb，由15個(gè)外顯子組成，最長的轉(zhuǎn)錄基因?yàn)?.7 kb，其編碼基因中含有1 226個(gè)腺苷脫氨酶(編碼含有1 226個(gè)氨基酸序列的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶)該酶能用于信使RNA中的中的序列與DNA上的酶不對應(yīng)，從而產(chǎn)生特定的生物學(xué)性能[4]。相關(guān)研究顯示該酶中存在2個(gè)Z區(qū)及1個(gè)alpha區(qū)，從而引導(dǎo)蛋白質(zhì)向發(fā)生轉(zhuǎn)錄的DNA靠近，同時(shí)對RNA產(chǎn)生作用[5]。雙鏈RNA結(jié)合區(qū)是由2～7號的外顯子進(jìn)行編碼的，能識別底物，同時(shí)與底物進(jìn)行結(jié)合[6]。如果該酶位點(diǎn)出現(xiàn)缺失會導(dǎo)致其不能形成二聚體，從而影響該基因的功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

引起該病突變的主要原因是基因的錯(cuò)義突變，其次是堿基插入或缺失引起的基因代碼出現(xiàn)無義性突變[7]。本研究采用PCR擴(kuò)增法對DSRAD基因進(jìn)行序列測定或全克隆，同時(shí)在采用SCCP技術(shù)進(jìn)行突變的鑒定，從而發(fā)現(xiàn)患者第1 167位點(diǎn)中的堿基由A替換為G，在正常家族人群或非血緣關(guān)系的人群中未出現(xiàn)此種突變。該突變一般情況下不會引起氨基酸序列的改變，但核苷酸改變會導(dǎo)致患者轉(zhuǎn)錄效率受到影響，同時(shí)氨基酸及密碼子的翻譯效率并不相同，可引起蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生變化，最終引起疾病發(fā)生[8]。

對DSRAD基因變異進(jìn)行分析，能有效了解對稱性色素遺傳異常疾病的發(fā)生的機(jī)理，從而為臨床對該病的診斷及治療提供臨床理論依據(jù)。

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Mutation analysis of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria.

YI Heng-an,LI Min,QIU Yu-fen.Department of Dermatology,Henggang People's Hospital of Longgang District of Shenzhen City,Shenzhen 518115,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo detect the mutation of DSRAD gene in a Chinese family with dyschromatosis symmetrica hereditaria(DSH),and to explore new pathogenic mutation.MethodsMembers of a Chinese family with DSH,who had typical rash,were enrolled in this study,with normal physical development and intelligence,no obvious systematic symptoms.RT-PCR was applied to obtain DSRAD gene cDNA from human peripheral blood.Proper gene sequences were selected and compared with corresponding gene of human gene pool to identify suspicious sites, and new mutations were validated by single strand conformation.ResultsDSRAD gene sequence analysis confirmed the presence of nucleotide substitutions in the patient's chromosomes,with Q389Q replaced by A1167G.The encoding amino acid was still glutamic acid,which indicated a synonymous mutation.Single strand conformation confirmed that the DNA of the patients was of the same family,and that the healthy members and non-kinship members were not detected with the coding gene.ConclusionThe abnormal changes of skin pigment may be due to synonymous mutations in gene.The mutation mechanism still needs further study.

Hereditary;Symmetry;Pigment;DSRAD gene;Mutation

R394

A

1003—6350（2013）09—1266—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0535

2012-12-14)

易恒安。E-mail：164460075@qq.com