鴉膽子油乳注射液靜脈給藥長期毒性實驗研究

隋蓮翠，戴學(xué)棟

（1.煙臺市萊陽中心醫(yī)院功能科，山東 萊陽 265200；2.山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所，山東 濟(jì)南 250033）

鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的成熟果實，其主要成分是鴉膽子苦素、鴉膽子苦內(nèi)酯、鴉膽子苦醇、糖甙等，單獨應(yīng)用可以抗癌[1-4]。鴉膽子油乳是以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳劑，臨床上鴉膽子油乳已廣泛應(yīng)用于肺癌、肝癌、食道癌等多種惡性腫瘤的治療[5-6]。鴉膽子油乳注射液主要成分為甘油、精制豆磷脂和精制鴉膽子油，為鴉膽子油與乳化劑制成的滅菌乳狀液體[7-8]。為探討鴉膽子油乳注射液靜脈注射的安全性，本文對其進(jìn)行了長期毒性研究。

1 材料與儀器

1.1 藥物配制 將鴉膽子油乳注射液用0.9%氯化鈉注射液稀釋成高、中、低三種不同劑量的溶液。在每次用藥前新鮮配制，將配制好后的藥物用牛皮紙包裝的容器保存。

1.2 試劑 實驗所用的試劑主要有燦爛甲酚蘭（批號：99-01-23，規(guī)格：10 g，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠）、檸檬酸三鈉（批號：20080624，規(guī)格：500 g，山東博山化學(xué)試劑廠）、乙二胺四乙酸二鉀鹽（批號：20070605，規(guī)格：100 g，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）、戊巴比妥鈉（批號：090205，規(guī)格：25 g，濟(jì)南誠言科技有限公司）、40%甲醛（批號：20100522，規(guī)格：500 ml，萊陽市康德化工有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備 實驗所用的主要儀器設(shè)備有HEMAVET-950型全自動血球計數(shù)儀，BS300型生化分析儀，C2000型血凝儀，S-2000型電解質(zhì)分析儀，TDL-5臺式低速大容量離心機，TIGE-1220型電子臺秤，AY-220型電子分析天平，YB-502型電子天平，病理所用儀器（包含TB-718包埋機、NP-B包埋機、TK-218攤烤片機）、TP1020生物組織脫水機、RM2235切片機。

1.4 實驗動物 選用長期毒性實驗常用動物SD大鼠，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，所用動物數(shù)量符合統(tǒng)計學(xué)和實驗的要求。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組 實驗動物共設(shè)四組，從檢疫適應(yīng)7 d的大鼠中挑選160只，隨機分為高、中、低劑量組和對照組，每組40只大鼠，雌雄各半。

2.2 給藥劑量 考慮到鴉膽子油乳的毒性及給藥周期，將給藥劑量設(shè)計為：高劑量組為10ml·kg-1·d-1，約相當(dāng)于臨床日最大用量的23倍；中劑量組為高劑量的1/3，為3.3 ml·kg-1·d-1，約相當(dāng)于臨床日最大用量的8倍；低劑量組為中劑量的1/3，為1.0 ml·kg-1·d-1，約相當(dāng)于臨床日最大用量的2.3倍，對照組為給予等容積的0.9%氯化鈉注射液。

2.3 實驗步驟 每天給動物靜脈給藥1次，每周給藥6 d，連續(xù)給藥26周，給藥容積為20 ml/kg。每日觀察動物的外觀體征、行為活動、呼吸情況、食欲情況和給藥局部反應(yīng)等。給藥13周時，每組各取10只動物；給藥26周時，每組各取20只動物；恢復(fù)期結(jié)束后取剩余所有動物，隔夜禁食11～14 h，將每只動物腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后，先對動物進(jìn)行外觀檢查，包括動物的一般外觀檢查、體內(nèi)各臟器、體液等的肉眼觀察。肉眼觀察后進(jìn)行取血，取血后進(jìn)行剖檢。摘取部分臟器用4%甲醛溶液固定后，用RM2235切片機制備2～3μm厚切片，用蘇木素伊紅進(jìn)行染色，并用顯微鏡觀察。

2.4 檢測項目 血液學(xué)檢查主要指標(biāo)包括：紅細(xì)胞計數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞容積(HCT)、平均紅細(xì)胞容積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白濃度(HB)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)及分類、血小板（PLT）、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分含量（NRBC%）等14項指標(biāo)。血液生化學(xué)檢查主要指標(biāo)包括：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、鈉(Na+)等15項指標(biāo)。病理檢查主要包括：腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮、垂體等30個臟器或組織。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用DAS 1.0中長毒指標(biāo)統(tǒng)計進(jìn)行分析，將各項指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，將各劑量組與對照組的各項指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 一般觀察指標(biāo) 實驗期間，鴉膽子油乳注射液高劑量組有3只大鼠死亡，死亡率為7.5%。鴉膽子油乳注射液中、低劑量組及對照組均無大鼠死亡。對照組、中、低劑量組以及高劑量組存活大鼠未見明顯異常反應(yīng)。

3.1.2 血液學(xué)指標(biāo) 將高劑量組與同期同性別對照組大鼠比較發(fā)現(xiàn)：給藥26周時，高劑量組雌性大鼠 MCV(t值為 3.096)、RDW(t值為 4.211)和NRBC%(t值為4.282)等指標(biāo)明顯升高(P＜0.01)，PLT指標(biāo)(t值為2.432)明顯降低(P＜0.05)；高劑量組雄性大鼠RBC指標(biāo)(t值為2.232)明顯降低(P＜0.05)，RDW（t值為6.587）、NRBC%(t值為4.747)等指標(biāo)明顯增大(P＜0.01)。高劑量組大鼠的其他血液學(xué)指標(biāo)及中、低劑量組大鼠在各時期檢查的全部血液學(xué)指標(biāo)與同時期同性別對照組大鼠進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3.1.3 血液生化學(xué)指標(biāo) 將高劑量組與同期同性別對照組大鼠比較發(fā)現(xiàn)：給藥26周時，高劑量組雌性大鼠血液BUN指標(biāo)（t值為2.293）明顯升高(P＜0.05)，Na+含量（t值為2.337）略有升高(P＜0.05)，低劑量組雌性大鼠血液Na+含量（t值為2.329）略有升高(P＜0.05)，但Na+的升高均不是很明顯，在正常的生理范圍內(nèi)。可以認(rèn)為Na+的升高僅有統(tǒng)計學(xué)意義，無生理學(xué)意義，與藥物的毒性無關(guān)。高劑量組大鼠的其他血液生化學(xué)指標(biāo)及中、低劑量組大鼠在各時期檢查的全部血液生化學(xué)指標(biāo)與同時期同性別對照組大鼠進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

3.1.4 病理學(xué)觀察 高劑量組死亡大鼠肝臟、中央靜脈及肝血竇擴(kuò)張并有瘀血，肝細(xì)胞呈灶性壞死，肺臟肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡內(nèi)有大量均質(zhì)紅染物。中、低劑量組的大鼠未見與藥物相關(guān)的病理組織學(xué)改變。

3.2 毒性評價

3.2.1 血液學(xué)指標(biāo) 高劑量組大鼠RDW、MCV、NRBC%等指標(biāo)升高，RBC、PLT等指標(biāo)降低。RDW變大表明紅細(xì)胞形態(tài)大小不均，說明鴉膽子油乳注射液高劑量可導(dǎo)致紅細(xì)胞形態(tài)異常；RBC指標(biāo)略有減少，但HB和HCT指標(biāo)無變化，說明紅細(xì)胞可能出現(xiàn)破裂或溶解；NRBC%指標(biāo)增多表明骨髓紅細(xì)胞系增生旺盛，判斷為各種增生性貧血引起的失血性貧血。結(jié)合以上分析，認(rèn)為鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量可能會導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)溶血性貧血。實驗中，鴉膽子油乳注射液高、中劑量組大鼠脾臟相對重量增大，可能與紅細(xì)胞的溶解和破裂有關(guān)。大鼠的溶血性貧血刺激脾臟的濾過功能代償性增加，導(dǎo)致了PLT指標(biāo)的減少。鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量對以上紅細(xì)胞系及脾臟相對重量的影響在停藥恢復(fù)6周后均恢復(fù)正常，說明鴉膽子油乳注射液對紅細(xì)胞系和脾臟的毒性作用具有可逆性。

3.2.2 血液生化學(xué)指標(biāo) 給藥26周時，鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量導(dǎo)致雌性大鼠BUN指標(biāo)明顯升高，表明大鼠的腎臟功能有可能遭到損傷。且高劑量組雌、雄大鼠腎臟相對重量明顯增大。結(jié)合以上分析，認(rèn)為鴉膽子油乳注射液10 ml·kg-1·d-1劑量可導(dǎo)致雌性大鼠腎臟功能出現(xiàn)損傷，但不會導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)組織病理學(xué)改變。在停藥恢復(fù)6周后，高劑量組雌性大鼠BUN指標(biāo)仍偏高，說明停藥恢復(fù)6周后，鴉膽子油乳注射液對大鼠腎功能的損傷仍無法恢復(fù)。

3.2.3 病理學(xué)結(jié)果 鴉膽子油乳注射液高劑量組死亡大鼠肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡內(nèi)有大量均質(zhì)紅染物并呈彌散性分布，判斷這兩只大鼠可能死于急性肺水腫。因此，認(rèn)為該劑量可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)急性肺水腫。

4 討 論

近年來，越來越多的中藥注射劑應(yīng)用于臨床，改變了傳統(tǒng)的給藥方式，在臨床上發(fā)揮著獨特的作用。但隨著其廣泛的應(yīng)用，中藥注射劑引起的不良反應(yīng)案例呈現(xiàn)上升趨勢。因此，進(jìn)行長期毒性實驗，預(yù)測藥物可能對人體產(chǎn)生的不良反應(yīng)，判斷藥物可能的靶器官，推測重復(fù)用藥的安全范圍，對安全用藥具有重要的意義。通過實驗觀察大鼠鴉膽子油乳注射液靜脈給藥連續(xù)26周后的毒性反應(yīng)、停藥后的延遲毒性以及可逆性，認(rèn)為長期靜脈給藥可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)急性肺水腫和溶血性貧血，可能的中毒靶器官為肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺及造血系統(tǒng)。綜合分析確定SD大鼠無毒反應(yīng)劑量為1.0 ml·kg-1·d-1，約為人類臨床劑量的2.3倍。

[1]于葉玲,唐 星.復(fù)方鴉膽子油亞微乳注射液中油酸在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2008,25(5):337-340.

[2]宋曉勇,劉瑜新.鴉膽子油乳注射劑不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J].中國藥師,2011(4):557-558.

[3]郭若燕,李國慶.鴉膽子油乳臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國民康醫(yī)學(xué),2008,20(10):1066.

[4]許慕明,吳 曉.鴉膽子油乳在結(jié)直腸癌術(shù)后輔助化療中的應(yīng)用[J].西部醫(yī)學(xué),2010,22(11):2068-2069.

[5]藍(lán)曉紅,周永剛.鴉膽子油乳注射液臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀評價[J].中外健康文摘,2008,5(8):163-165.

[6]石修璞,趙浩如.鴉膽子油的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志,2010,25(3):240-242.

[7]楊利輝,石文建.鴉膽子油乳注射液對SKMG-4膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,4:22-24.

[8]居 靖,李曉娟.114例鴉膽子油乳注射液不良反應(yīng)/事件分析[J].中國藥物警戒,2009,6(10):606.