釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用的研究

釀酒酵母是發(fā)酵工業(yè)的重要微生物，主要用于酒精、啤酒和面包工業(yè)。傳統(tǒng)的釀酒酵母選育改良方法主要為自然篩選、誘變育種和雜交育種，但這些方法專一性不強?；蚬こ碳夹g(shù)提高了選育及改良釀酒酵母方法的特異性。隨著1996年釀酒酵母全基因組測序工作的完成，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建釀酒酵母基因工程菌已經(jīng)成為當(dāng)前的主流?？茖W(xué)家們也為釀酒酵母相應(yīng)地構(gòu)建了多種有效的質(zhì)粒載體，并探索出相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)化方法。

近年來，江南大學(xué)陳堅教授的研究團隊對釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建及應(yīng)用進行了大量、深入的研究。CN201110127826.0公開了一種產(chǎn)丙酮酸的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該發(fā)明通過敲除釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C)硫胺素合成途徑的關(guān)鍵調(diào)控基因THI2，干擾硫胺素的合成代謝，進而降低丙酮酸代謝關(guān)鍵酶(丙酮酸脫羧酶)的酶活性，從而減少通向乙醇的碳代謝流，最終促進丙酮酸的積累。該釀酒酵母基因工程菌在硫胺素限量添加的條件下，可積累丙酮酸，方法簡單，產(chǎn)量可達6.77±0.14g/L，為研究代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)C4二羧酸奠定了基礎(chǔ)。CN201110091340.6公開了一種高產(chǎn)乳酸工程菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用，其通過游離表達的方式，將源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)過量表達于整合了乳酸脫氫酶(LDH)的工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]中，構(gòu)建了L-乳酸合成能力進一步提高的基因工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]-nox。該菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵100 h后，發(fā)酵液中L-乳酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株增加了33%，達到20 g/L，而乙醇積累量則下降了49%，為8.2 g/L。CN201110355356.3公開了一種低產(chǎn)尿素的黃酒酵母代謝工程菌及其構(gòu)建方法，是將脲基酰胺酶基因DUR1，2編碼框置于釀酒酵母組成型高表達TPI1轉(zhuǎn)錄啟動子和TPI1轉(zhuǎn)錄終止子控制之下，通過同源重組將TPI1p-DUR1，2-TPI1t基因盒穩(wěn)定整合入菌株黃酒酵母菌株基因組中得到的黃酒酵母代謝工程菌；該發(fā)明的黃酒酵母代謝工程菌株具有明顯的產(chǎn)尿素水平低的特點，利用其發(fā)酵生產(chǎn)的黃酒EC含量低，且風(fēng)味基本保持不變。CN201010559061.3公開了一種產(chǎn)延胡索酸的釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。該發(fā)明從能夠大量積累延胡索酸的米根霉(Rhizopusoryzae NRRL1526)克隆延胡索酸積累途徑中的關(guān)鍵基因蘋果酸脫氫酶基因(RoMDH)和富馬酸酶基因(RoFUM1)，通過連接到能在釀酒酵母中高拷貝雙向表達質(zhì)粒pY26TEF/GPD，轉(zhuǎn)化釀酒酵母（Saccharomy cescerevisiae BMA64），獲得產(chǎn)延胡索酸的釀酒酵母基因工程菌，產(chǎn)量可達26.2 mg/L。陸健在CN201110410845.4中公開了一種通過“自克隆”手段構(gòu)建低產(chǎn)尿素黃酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。該工程菌中精氨酸酶基因(CAR1)被破壞，從而降低黃酒酵母對精氨酸的代謝，減少黃酒醪液中尿素的含量，進而降低黃酒中氨基甲酸乙酯(EC)的含量。采用本基因工程菌發(fā)酵后，尿素含量可降低73%，氨基甲酸乙酯含量也會大幅降低。馬正，饒志明等（2007）研究了一步法產(chǎn)1,3-丙二醇釀酒酵母基因工程菌，其將分別來源于大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串聯(lián)表達，構(gòu)建重組表達載體pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB；并得到重組釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。該重組菌和對照S.cerevisiae分別以葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵72 h后,重組釀酒酵母發(fā)酵液中1,3-PD含量約為1.5 g/L；而對照菌株不產(chǎn)1,3-PD。王付轉(zhuǎn)（2008）采用遺傳改良技術(shù)，使釀酒酵母絮凝基因FLO1在發(fā)酵性能優(yōu)良的工業(yè)釀酒酵母中表達，得到絮凝重組工業(yè)釀酒酵母菌株，以利于在酒精發(fā)酵末期利用酵母自身的絮凝沉降能力從醪液中分離細胞，節(jié)約酒精生產(chǎn)能源成本。

由于基因重組釀酒酵母在諸多方面具有潛在優(yōu)勢，加上現(xiàn)代生物工程技術(shù)的飛速發(fā)展，其開發(fā)利用具有廣闊的前景。