全自動微生物定量分析儀在食品檢測中的應(yīng)用

于曉婕，孫秋影，李蓉娟，陳曉東，李雪梅，施東福，于杰，*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610065；2.國家農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧東港 118300；3.遼寧丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧丹東 118000）

全自動微生物定量分析儀在食品檢測中的應(yīng)用

于曉婕1，孫秋影2，李蓉娟2，陳曉東3，李雪梅2，施東福2，于杰2，*

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610065；2.國家農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧東港 118300；3.遼寧丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧丹東 118000）

摘 要：微生物污染引起的食源性疾病是世界食品安全最突出的問題之一，采取有效方法對食品微生物進(jìn)行檢測是非常必要的。主要對全自動微生物定量檢測方法與傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行比對分析，并采用這兩種方法對海產(chǎn)品及烘干雞肉進(jìn)行微生物檢測，結(jié)果表明全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測的準(zhǔn)確性和敏感性均較高，但也有其局限性。

關(guān)鍵詞：微生物檢測；食品安全；全自動微生物定量分析儀（TEMPO）

食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，近幾年來，安全問題越來越受到人們的重視，微生物對食品的污染問題也相應(yīng)的受到人們的關(guān)注。微生物在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售等各個環(huán)節(jié)都有可能污染食品，一旦污染，便會大量繁殖，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，引起食源性污染和食物中毒。而現(xiàn)在環(huán)境污染和生態(tài)破壞日益加劇，可導(dǎo)致人類感染和中毒的致病菌種類也越來越多。為了防止此類中毒事件的發(fā)生，采取適當(dāng)有效的食品微生物檢測方法，是避免和預(yù)防微生物食源性污染的重要手段。而傳統(tǒng)的檢測方法實(shí)驗(yàn)繁雜、耗時(shí)較長、工作繁重[1-2]。因此，人們開始研究食品微生物檢驗(yàn)的新途徑，尋找微生物檢測的新載體，全自動微生物定量分析儀（TEMPO）就是在這種新思路下而產(chǎn)生的新型微生物檢測儀，它是在建立MPN方法[3-5]的基礎(chǔ)上，以16管的形式改良成一個單獨(dú)的耗材、最小化的卡片，利用發(fā)生特應(yīng)的酶反應(yīng)檢測相應(yīng)的熒光信號來判讀微生物的指標(biāo)。

當(dāng)前，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)蓬勃發(fā)展，而微生物檢測技術(shù)也融合了生理學(xué)、生化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)和電子技術(shù)等多種學(xué)科[6]，不斷創(chuàng)造檢測的新方法，尋找新思路。傳統(tǒng)的微生物檢測需要大量的器皿、長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作和試驗(yàn)后消毒工作[7]，操作復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長，而全自動微生物定量分析儀（TEMPO）操作簡便易行，特定的試劑無需大量人力，批量操作省時(shí)省力。本文以海產(chǎn)品及烘干雞肉的微生物檢測為例，分別從菌落總數(shù)計(jì)數(shù)、大腸菌群計(jì)數(shù)、大腸桿菌計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)以及腸桿菌科計(jì)數(shù)等檢測項(xiàng)目上，對比國標(biāo)方法與TEMPO，以此評價(jià)全自動微生物定量分析儀（TEMPO）的的優(yōu)勢和不足。

1 材料

1.1 樣品

海產(chǎn)品及烘干雞肉（寵物食品）：由國家農(nóng)獸藥殘留及海洋生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室樣品收樣室提供。

1.2 儀器及試劑

全自動微生物檢測儀以及相應(yīng)所使用的檢測卡片與試劑由法國梅里埃公司生產(chǎn)；傳統(tǒng)檢驗(yàn)所用的培養(yǎng)基以及各種試劑均由OXOID公司所生產(chǎn)。各種試劑以及培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)使用。

2 檢測方法與結(jié)果

2.1 菌落總數(shù)檢測

菌落計(jì)數(shù)是用來監(jiān)督產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量并能提示產(chǎn)品是否新鮮或者已腐敗的一項(xiàng)重要指標(biāo)。同一樣品進(jìn)行取樣、稀釋、然后分別按照國標(biāo)GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[8]和全自動微生物自動分析儀（TEMPO）進(jìn)行檢測。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）對菌落總數(shù)的檢測方法和NF EN ISO 4833[9]標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)男阅芩?。它是將樣本接種到培養(yǎng)基，再通過TEMPO充填器傳輸?shù)接?種不同規(guī)格的48孔卡片中。同時(shí)充填器也會密封卡片以此避免在隨后的處理過程中帶來的污染的風(fēng)險(xiǎn)。將國標(biāo)法所做的平板連同卡片一同在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，卡片中存在的微生物分解培養(yǎng)基中的底物，并產(chǎn)生能被TEMPO讀數(shù)器檢測到的熒光信號。48 h后分別讀取平板菌落數(shù)和卡片菌落數(shù)。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）是依照MPN方法的原理，TEMPO系統(tǒng)根據(jù)陽性孔的大小和數(shù)目來推算出原始樣本中的微生物總數(shù)。共檢測432份水產(chǎn)品樣品，通過與國標(biāo)比對，其和平板計(jì)數(shù)的符合率為89%，對其不符合的樣品進(jìn)行多次重復(fù)的檢測與分析研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些不符合樣品全是酶活力較強(qiáng)的水生軟體動物，這些酶活力較強(qiáng)的物品會影響底物的反應(yīng)，從而導(dǎo)致全自動微生物定量分析儀（TEMPO）讀取的熒光信號變化，試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)高酶活可以降低對底物的這種影響。而同組其它樣品檢驗(yàn)效果均一致，由此而知，全自動微生物定量分析儀（TEMPO）可以用做批量菌落檢測但是有其局限性。

2.2 大腸菌群計(jì)數(shù)檢測

大腸菌群計(jì)數(shù)在食品質(zhì)量監(jiān)測方面十分有效。陽性結(jié)果可能預(yù)示著食品加工過程中或加工環(huán)境存在著問題。432份樣品進(jìn)行全自動微生物定量分析儀（TEMPO）和國標(biāo)法GB 4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[10]檢測。TEMPO的大腸菌群計(jì)數(shù)檢測有TC和CC兩種方法，操作方法同樣但是分別有兩種不同的培養(yǎng)基試劑。TEMPO TC的開發(fā)是為了獲得NF ISO 4832[11]標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)性能水平。TEMPO CC法是TEMPO儀器上根據(jù)BAM[12]方法專門用于24 h計(jì)數(shù)食品中大腸菌群的方法。該方法是為了獲得和AOACR官方方法966.24及美國公共健康聯(lián)合會檢測乳制品標(biāo)準(zhǔn)方法（SMEDP）一致的效果[13]?？ㄆ?套不同大小的16孔組成（小，中，大），每種類型孔的容量相差一個對數(shù)。培養(yǎng)基中含能發(fā)出被TEMPO讀數(shù)器檢測到信號的中性熒光底物。培養(yǎng)期間，如果卡片中存在大腸菌群則分解營養(yǎng)底物，pH下降，熒光信號減弱。依照MPN方法的原理，TEMPO系統(tǒng)根據(jù)陽性孔的大小和數(shù)目來推算出原始樣本中的大腸菌群數(shù)。樣品同時(shí)進(jìn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢測，432份樣品通過其和傳統(tǒng)的國標(biāo)法檢測結(jié)果進(jìn)行對比，符合率為99%。說明全自動微生物定量分析儀（TEMPO）能夠滿足本實(shí)驗(yàn)室大腸菌群的檢測，但由于本實(shí)驗(yàn)室樣品局限性，可能并不能充分說明該法的使用范圍及其影響因素，有待進(jìn)一步研究。

2.3 大腸桿菌技術(shù)檢測

大腸桿菌是人和動物的共同寄居菌。該種細(xì)菌大量繁殖可能會造成食物中毒。某些菌種被認(rèn)為是致病性的并能產(chǎn)生一種或更多種的毒素。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）所配套的試劑EC是專門用于24 h檢測計(jì)數(shù)大腸桿菌的。該方法達(dá)到與ISO 16649-2：2001《食品和動物飼料的微生物學(xué)例舉葡萄糖苷酸酶陽性大腸桿菌計(jì)數(shù)方法，第二部分：44℃溫度下利用5溴-4氯-3吲哚-D-葡糖苷酸的菌落計(jì)數(shù)技術(shù)》[14]標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)性能水平。培養(yǎng)期間，有大腸桿菌存在的卡片就會還原培養(yǎng)基中的底物并產(chǎn)生可被TEMPO讀數(shù)器檢測到的熒光信號。參照MPN方法，TEMPO系統(tǒng)根據(jù)陽性孔的數(shù)目和大小來推算出原始樣本中的大腸桿菌數(shù)量。樣品同時(shí)按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.38-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸桿菌計(jì)數(shù)》[15]檢測，兩者結(jié)果進(jìn)行對比，符合率為86%，準(zhǔn)確度無差異并對不符合的樣品經(jīng)行多次重復(fù)檢測，通過分析顯示該法可以滿足實(shí)驗(yàn)室批量檢測的需要，但是對與高酶活性的樣品不可適用，尤其是高酶活性的水生軟體動物，并通過多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大稀釋倍數(shù)可以降低高酶活的干擾。

2.4 金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)檢測

金黃色葡萄球菌能夠引起細(xì)菌性食物中毒，其對水產(chǎn)品的污染將嚴(yán)重影響到食品安全和水產(chǎn)品加工出口貿(mào)易。TEMPPO-STA是利用凝固酶的原理通過熒光值的判讀來進(jìn)行葡萄球菌的計(jì)數(shù)。崔巖，田卓等[16]利用TEMPO/STA法與PetrifilmTM測試片法兩種方法對535個出口水產(chǎn)品進(jìn)行了檢測比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩法一致性較好（符合率96.6%，準(zhǔn)確度無差異）。本文通過國標(biāo)GB 4789.10-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[17]檢測與TEMPPOSTA的檢測進(jìn)行比較，結(jié)果其符合率達(dá)到97%，準(zhǔn)確度無差異，而TEMPO/STA法又具有操作簡便，人為誤差小的特點(diǎn)，故其將成為重要的檢測手段。

2.5 腸桿菌科技術(shù)檢測

腸桿菌科的細(xì)菌是食品工業(yè)的主要指標(biāo)，因?yàn)槠渫瑫r(shí)包括腸道致病菌和重要的食物腐敗因子，因此被廣泛地作為食品衛(wèi)生和安全的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)c桿菌科的樣品主要為烘干雞肉（寵物食品）。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）腸桿菌科檢驗(yàn)所采用的卡片用于22 h～27 h（35±1）°C計(jì)數(shù)樣品中腸桿菌的卡片，從而判斷是否受污染。該卡片的開發(fā)是為了獲得和EN ISO 21528-2標(biāo)準(zhǔn)相當(dāng)?shù)男Ч鸞18]。同樣按照行標(biāo)SN/T 0738-1997《出口食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法》[19]進(jìn)行檢測，兩者結(jié)果對比，其符合度達(dá)到97%，準(zhǔn)確度無差異。該法可以用做本實(shí)驗(yàn)室的批量試驗(yàn)要求，但由于其樣品的局限性對其他樣品的準(zhǔn)確性不能確定，有待進(jìn)一步研究。

3 討論

全自動微生物定量分析儀（TEMPO）與國標(biāo)方法相比，能夠滿足準(zhǔn)確性的要求，省去了傳統(tǒng)試驗(yàn)方法中繁瑣而耗時(shí)的檢測步驟，對于批量檢測更為輕松[20]，實(shí)驗(yàn)過后的滅菌以及清理工作也變得非常簡單。隨著科技的進(jìn)步，機(jī)器自動化代替手工是全世界各行業(yè)的一個趨勢[21]，TEMPO方法是食品行業(yè)中第一個用于食品和環(huán)境樣品的質(zhì)量指標(biāo)生物計(jì)數(shù)的自動化質(zhì)量指標(biāo)測試系統(tǒng)。自動化指標(biāo)測試使得食品制造商只需有限的時(shí)間和資源用于技術(shù)條件不能檢測的陽性測試樣本的后續(xù)試驗(yàn)。指標(biāo)測試通常尋找微生物，這些微生物是反映嚴(yán)重病原體存在的重要指標(biāo)。相比那些非常耗時(shí)的細(xì)菌培養(yǎng)和平板計(jì)數(shù)讀取，TEMPO通過自動化加快了這一耗時(shí)的過程，同時(shí)提供優(yōu)質(zhì)而一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并省去通過主觀方式平板讀數(shù)的過程，同時(shí)保持了樣品從準(zhǔn)備到最終報(bào)告完成的結(jié)果的可追溯性。

通過兩種方法的比對分析我們不難發(fā)現(xiàn)，一些高酶活性樣品以及顏色較重的樣品均對結(jié)果產(chǎn)生影響。這說明TEMPO全自動微生物定量分析儀（TEMPO）的有一些局限性。一般情況下，高酶活性的樣品會對細(xì)菌總數(shù)檢測和大腸桿菌計(jì)數(shù)檢測產(chǎn)生干擾，通過大量的實(shí)驗(yàn)證明，擴(kuò)大稀釋度，可以減弱這種干擾，但是卻不能消除。通常含有發(fā)酵劑的食品、面粉、蛋糕、生面團(tuán)、容易受到含有強(qiáng)抑制劑（例如香料、高鹽分產(chǎn)品）或者深色產(chǎn)品（可可粉）等樣品用TEMPO檢測時(shí)候會受到干擾。

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，可以預(yù)料在不遠(yuǎn)的將來，傳統(tǒng)的微生物檢測技術(shù)將漸被各種新型簡便的微生物快速診斷技術(shù)所取代。全自動微生物定量分析儀（TEMPO）具有廣闊的前景。目前TEMPO檢測的項(xiàng)目還比較局限，檢測樣品也有所區(qū)別，但是微生物檢測計(jì)數(shù)一直在不斷發(fā)展，不斷在創(chuàng)新，TEMPO將成為未來重要的檢測手段之一，有待于進(jìn)一步開發(fā)利用。相信憑借著TEMPO檢測儀的發(fā)展檢測自動化時(shí)代即將到來。

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The Automatic Microorganism Quantitative Analyzer Apply in Test of Food Microorganism

YU Xiao-jie1，SUN Qiu-ying2，LI Rong-juan2，CHEN Xiao-dong3，LI Xue-mei2，SHI Dong-fu2，YU Jie2，*
（1.College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610065，Sichuan，China；2.National Key Laboratory of Pesticid and Veterinary Drug Residue and Marine biotonix Detection，Donggang 118300，Liaoning，China；3.Dan dong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dandong 118000，Liaoning，China）

Abstract：Foodborne disease caused by Microbial pollution is one of the most outstanding issues of the world's food safety，take effective methods for food microorganism detection is necessary.This paper introduced the difference of the automatic microbiological quantitative detection method and the traditional detection method，and the use of two methods on seafood and dried chicken to test microorganisms，the results showed that automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）test accuracy and sensitivity was higher，but it had its limitations.

Key words：the test of microorganisms；food safety；the automatic microorganism quantitative analyzer（TEMPO）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.001

國家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目（2008IK001）

于曉婕（1991—），女（漢），學(xué)士，主要從事微生物研究。

于杰（1963—），男（漢），學(xué)士，主要從事食品微生物檢驗(yàn)工作。

2012-10-10