中藥對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的擬雌激素活性拮抗作用*

蔡德培 蘆軍萍

（上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海 201102）

我院近二十年來(lái)，對(duì)兒童性早熟的發(fā)病規(guī)律、診斷及治療進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究，并制定了一套以中藥為主的治療方案，在臨床上取得了顯著療效[1]。本文在既往采用中藥成功治療性早熟的理論及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，制定了針對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupters, EEDs)擬雌激素作用的中藥治療方案，治療受EEDs污染的性早熟患兒及染毒動(dòng)物，并以生殖器官及骨骼發(fā)育水平作為指標(biāo)，驗(yàn)證該治療方案對(duì)EEDs擬雌激素活性的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 臨床實(shí)驗(yàn)

1.1.1 研究對(duì)象

臨床上篩查出EEDs暴露水平較高的性早熟女孩73例，起病年齡6.2～8.3歲，初診年齡6.5～11.3歲。

1.1.2 藥物及治療方法

中藥方劑由生地、炙龜板、黃柏、知母等組成。由本院中藥制劑室煎制成濃縮合劑，每ml約含生藥2.5 g。每日3次，每次30 ml，療程為3個(gè)月。

1.1.3 評(píng)估方法

子宮、卵巢體積測(cè)定 以Hitachi EUB 40型二維超聲診斷儀測(cè)量子宮體和卵巢的長(zhǎng)、寬、厚徑，按（π/6×長(zhǎng)×寬×厚) ml公式分別計(jì)算子宮體積和兩側(cè)卵巢的體積。

骨礦含量及骨密度測(cè)定 采用pDEXA型雙能X線吸收骨礦分析儀測(cè)定左側(cè)橈、尺骨的骨礦含量及骨密度。

血清雌二醇（estradiol，E2）及血清骨鈣素（OST）檢測(cè) 采用放射免疫分析法測(cè)定血清E2及OST含量，試劑盒分別由美國(guó)DPC公司及中國(guó)原子能科學(xué)研究院提供。

1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，治療前后的對(duì)比采用自身配對(duì)t檢驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

3周齡Sprague Dawley (SD)系大鼠，雌性40只，體重（50.00±2.00）g，購(gòu)自上海斯萊克凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0003]。清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度為（22.00±3.00）℃；相對(duì)濕度為50.00%～60.00%，12/12小時(shí)明暗周期；動(dòng)物食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水和攝食。

1.2.2 染毒動(dòng)物模型的制備

1）EEDs染毒液的配置 精確稱取壬基酚(4-NP)及雙酚A(BPA)（顆粒狀提前研磨至粉末），以市售精制大豆油為溶劑，逐滴加入大豆油至染毒物全部溶解或呈乳濁液狀后，加入足量大豆油使其終濃度分別為10 mg/ml（4-NP）和 40 mg/ml（BPA）。

2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本處理

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組8只。

4-NP實(shí)驗(yàn)組 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)

4-NP治療組 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)＋中藥合劑40 ml/kg

BPA實(shí)驗(yàn)組 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)

BPA治療組 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)+中藥合劑40 ml/kg

溶劑對(duì)照組 溶劑10 ml/kg（1 ml/100 g）

每天灌胃1次，療程14 d。給藥期間每天稱重，根據(jù)體重調(diào)整藥量。于末次給藥24 h后稱重，以3.00%水合氯醛腹腔麻醉處死。迅速剝離子宮稱取濕重，計(jì)算臟器系數(shù)（子宮濕重/體重）。取兩側(cè)股骨去除肌肉及韌帶組織后-20 ℃進(jìn)行凍存待測(cè)。子宮稱重后，中性福爾馬林固定24～48 h后進(jìn)行石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5 μm，常規(guī)HE染色后鏡檢。

3）中藥合劑的藥物組成及制作 方法同臨床部分。

1.2.3 評(píng)估方法

1)子宮內(nèi)膜及平滑肌測(cè)量方法 Panasonic MV-CP410型攝像機(jī)進(jìn)行圖像采集，采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，放大倍數(shù)為100倍，測(cè)量HE切片子宮內(nèi)膜上皮高度和平滑肌厚度。每張切片均隨機(jī)選取4個(gè)視野，取平均值。

2)子宮內(nèi)膜上皮的細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用常規(guī)免疫組化方法（ABC法）檢測(cè)PCNA的表達(dá)，一抗為小鼠抗大鼠PCNA單克隆IgG2a抗體。以IMS細(xì)胞圖像分析軟件，測(cè)定子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的面積。每張切片均隨機(jī)選取4個(gè)視野，取其平均值。

3)骨密度測(cè)定 采用pDEXA型雙能X線吸收骨礦分析儀測(cè)定兩側(cè)股骨的骨密度，取其平均值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5軟件包，正態(tài)分布變量采用單因素方差分析方法，方差不齊時(shí)，用Tamhane檢驗(yàn)，非正態(tài)分布變量用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 臨床部分

2.1.1 中藥治療對(duì)性早熟患兒生殖器官發(fā)育及血清E2水平的影響

可見(jiàn)篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒，經(jīng)中藥治療3個(gè)月后，子宮體積較治療前明顯減?。≒＜0.01）；血清 E2含量較治療前明顯下降（P＜0.01，表 1）。

2.1.2 中藥治療對(duì)性早熟患兒骨骼發(fā)育指標(biāo)的影響

可見(jiàn)篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒經(jīng)中藥治療3個(gè)月后，患兒骨礦含量、骨密度明顯降低，血清骨鈣素含量均顯著下降（P＜0.01，表2）。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分

表1 性早熟患兒治療前后子宮、卵巢體積、血清E2含量的變化(±s)

表1 性早熟患兒治療前后子宮、卵巢體積、血清E2含量的變化(±s)

注： *與治療前相比，P＜0.01

分組 例數(shù) 子宮體積（ml）卵巢體積（ml）血清E2含量（pmol/L）治療前 73 4.0±0.5 1.6±0.3 174.84±16.40治療后 73 2.6±0.4* 1.4±0.3 85.91±9.65*

表2 性早熟患兒治療前后骨骼發(fā)育指標(biāo)的變化(±s)

表2 性早熟患兒治療前后骨骼發(fā)育指標(biāo)的變化(±s)

注：*與治療前相比，P＜0.01

分組 例數(shù) 骨礦含量（g/cm）骨密度（g/cm2）血清骨鈣素（μg/L）治療前 73 0.552±0.080 0.537±0.067 16.85±3.16治療后 73 0.399±0.093* 0.417±0.056* 10.06±3.37*

2.2.1 中藥治療對(duì)染毒動(dòng)物子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響

可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組與溶劑對(duì)照組相比，子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度均顯著增高，說(shuō)明4-NP及BPA對(duì)生殖器官及骨骼均有顯著的擬雌激素作用；而治療組與實(shí)驗(yàn)組相比子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度均顯著下降，說(shuō)明所用中藥對(duì)4-NP及BPA的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用（表3）。

表3 中藥對(duì)EEDs作用下幼雌SD大鼠子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響(±s)

表3 中藥對(duì)EEDs作用下幼雌SD大鼠子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響(±s)

注：#與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05，*與實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05

分組 例數(shù) 子宮濕重(mg) 臟器系數(shù)(‰) 骨密度（g/cm2）4-NP 實(shí)驗(yàn)組 8 0.081±0.009# 0.74±0.13# 0.0822±0.019#4-NP 治療組 8 0.055±0.008* 0.48±0.12* 0.0553±0.0117*BPA實(shí)驗(yàn)組 8 0.067±0.007# 0.61±0.13# 0.0940±0.0172#BPA治療組 8 0.051±0.005* 0.40±0.05* 0.0596±0.008*溶劑對(duì)照組 8 0.042±0.007 0.36±0.02 0.0651±0.0101

2.2.2 中藥治療對(duì)染毒動(dòng)物子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達(dá)的影響

可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組與溶劑對(duì)照組相比，子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表達(dá)水平均顯著增高，說(shuō)明4-NP及BPA對(duì)生殖器官具有顯著的擬雌激素作用；而治療組與實(shí)驗(yàn)組相比，子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表達(dá)水平均顯著下降，說(shuō)明所用中藥對(duì)4-NP及BPA的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用（表4）。

3 討論

EEDs可通過(guò)與靶器官上的雌激素受體（ER）結(jié)合發(fā)揮擬雌激素作用。ER具有多個(gè)配體結(jié)合部位，除能與天然雌激素結(jié)合外，還可與多種EEDs結(jié)合。EEDs與ER結(jié)合后可激活ER啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)蛋白合成，也可以與天然雌激素發(fā)揮協(xié)同作用，激發(fā)雌激素效應(yīng)的產(chǎn)生[2]。

本研究臨床部分的結(jié)果顯示，對(duì)篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒，給予中藥合劑口服治療3個(gè)月后，患兒的子宮體積明顯回縮，血清E2含量顯著下降，骨礦含量、骨密度及血清OST含量也顯著下降，說(shuō)明中藥合劑對(duì)EEDs在患兒生殖器官及骨骼上的擬雌激素效應(yīng)具有顯著的拮抗作用。

表4 中藥對(duì)EEDs作用的幼雌SD大鼠子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達(dá)的變化(±s)

表4 中藥對(duì)EEDs作用的幼雌SD大鼠子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達(dá)的變化(±s)

注：#與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05；*與實(shí)驗(yàn)組比較，P＜0.05

分組 n 內(nèi)膜上皮高度(μm) 平滑肌厚度(μm) 陽(yáng)性細(xì)胞面積(μm2)4-NP實(shí)驗(yàn)組 8 23.27±5.64# 82.29±13.92# 5 490.25±678.58#4-NP治療組 8 17.45±4.30* 55.20±10.20* 4 301.59±464.02*BPA 實(shí)驗(yàn)組 8 20.85±2.94# 68.27±7.42# 5 062.76±182.34#BPA治療組 8 16.63±3.42* 48.77±5.03* 4 114.62±223.80*溶劑對(duì)照組 8 9.75±2.59 33.66±5.60 3 350.55±394.15

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分的結(jié)果顯示EEDs可使染毒動(dòng)物子宮增重、子宮內(nèi)膜及平滑肌增生、子宮內(nèi)膜PCNA的蛋白表達(dá)上調(diào)、骨密度增高，說(shuō)明EEDs對(duì)生殖器官及骨骼均具有顯著的擬雌激素作用；同時(shí)喂飼中藥合劑可使染毒動(dòng)物生殖器官及骨骼的病變顯著減輕，進(jìn)一步印證了臨床觀察的結(jié)果，證實(shí)所用的中藥合劑對(duì)EEDs的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用。

[1] 蔡德培. 性早熟及青春期延遲[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2005: 163-171.

[2] Simons SS Jr. Environmental estrogens: Can two “Alrights ”make a wrong?[J]. Science, 1996, 272(5267): 1451.