蔡德培 蘆軍萍
(上海復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海 201102)
我院近二十年來,對兒童性早熟的發(fā)病規(guī)律、診斷及治療進行了系統(tǒng)深入的研究,并制定了一套以中藥為主的治療方案,在臨床上取得了顯著療效[1]。本文在既往采用中藥成功治療性早熟的理論及實踐經(jīng)驗的基礎(chǔ)上,制定了針對環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupters, EEDs)擬雌激素作用的中藥治療方案,治療受EEDs污染的性早熟患兒及染毒動物,并以生殖器官及骨骼發(fā)育水平作為指標,驗證該治療方案對EEDs擬雌激素活性的拮抗作用。
1.1.1 研究對象
臨床上篩查出EEDs暴露水平較高的性早熟女孩73例,起病年齡6.2~8.3歲,初診年齡6.5~11.3歲。
1.1.2 藥物及治療方法
中藥方劑由生地、炙龜板、黃柏、知母等組成。由本院中藥制劑室煎制成濃縮合劑,每ml約含生藥2.5 g。每日3次,每次30 ml,療程為3個月。
1.1.3 評估方法
子宮、卵巢體積測定 以Hitachi EUB 40型二維超聲診斷儀測量子宮體和卵巢的長、寬、厚徑,按(π/6×長×寬×厚) ml公式分別計算子宮體積和兩側(cè)卵巢的體積。
骨礦含量及骨密度測定 采用pDEXA型雙能X線吸收骨礦分析儀測定左側(cè)橈、尺骨的骨礦含量及骨密度。
血清雌二醇(estradiol,E2)及血清骨鈣素(OST)檢測 采用放射免疫分析法測定血清E2及OST含量,試劑盒分別由美國DPC公司及中國原子能科學(xué)研究院提供。
1.1.4 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件,治療前后的對比采用自身配對t檢驗。
1.2.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件
3周齡Sprague Dawley (SD)系大鼠,雌性40只,體重(50.00±2.00)g,購自上海斯萊克凱實驗動物有限責任公司[許可證號:SCXK(滬)2003-0003]。清潔級動物房,溫度為(22.00±3.00)℃;相對濕度為50.00%~60.00%,12/12小時明暗周期;動物食用標準顆粒飼料,自由飲水和攝食。
1.2.2 染毒動物模型的制備
1)EEDs染毒液的配置 精確稱取壬基酚(4-NP)及雙酚A(BPA)(顆粒狀提前研磨至粉末),以市售精制大豆油為溶劑,逐滴加入大豆油至染毒物全部溶解或呈乳濁液狀后,加入足量大豆油使其終濃度分別為10 mg/ml(4-NP)和 40 mg/ml(BPA)。
2)實驗動物分組及標本處理
將實驗動物隨機分為5組,每組8只。
4-NP實驗組 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)
4-NP治療組 100 mg/kg(1.0 ml/100 g)+中藥合劑40 ml/kg
BPA實驗組 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)
BPA治療組 400 mg/kg(1.0 ml/100 g)+中藥合劑40 ml/kg
溶劑對照組 溶劑10 ml/kg(1 ml/100 g)
每天灌胃1次,療程14 d。給藥期間每天稱重,根據(jù)體重調(diào)整藥量。于末次給藥24 h后稱重,以3.00%水合氯醛腹腔麻醉處死。迅速剝離子宮稱取濕重,計算臟器系數(shù)(子宮濕重/體重)。取兩側(cè)股骨去除肌肉及韌帶組織后-20 ℃進行凍存待測。子宮稱重后,中性福爾馬林固定24~48 h后進行石蠟包埋,連續(xù)切片,片厚5 μm,常規(guī)HE染色后鏡檢。
3)中藥合劑的藥物組成及制作 方法同臨床部分。
1.2.3 評估方法
1)子宮內(nèi)膜及平滑肌測量方法 Panasonic MV-CP410型攝像機進行圖像采集,采用IMS細胞圖像分析系統(tǒng)醫(yī)學(xué)圖像分析軟件,放大倍數(shù)為100倍,測量HE切片子宮內(nèi)膜上皮高度和平滑肌厚度。每張切片均隨機選取4個視野,取平均值。
2)子宮內(nèi)膜上皮的細胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表達的檢測 采用常規(guī)免疫組化方法(ABC法)檢測PCNA的表達,一抗為小鼠抗大鼠PCNA單克隆IgG2a抗體。以IMS細胞圖像分析軟件,測定子宮內(nèi)膜上皮細胞PCNA陽性細胞的面積。每張切片均隨機選取4個視野,取其平均值。
3)骨密度測定 采用pDEXA型雙能X線吸收骨礦分析儀測定兩側(cè)股骨的骨密度,取其平均值。
1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法
應(yīng)用SPSS 11.5軟件包,正態(tài)分布變量采用單因素方差分析方法,方差不齊時,用Tamhane檢驗,非正態(tài)分布變量用Kruskal-Wallis檢驗。
2.1.1 中藥治療對性早熟患兒生殖器官發(fā)育及血清E2水平的影響
可見篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒,經(jīng)中藥治療3個月后,子宮體積較治療前明顯減?。≒<0.01);血清 E2含量較治療前明顯下降(P<0.01,表 1)。
2.1.2 中藥治療對性早熟患兒骨骼發(fā)育指標的影響
可見篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒經(jīng)中藥治療3個月后,患兒骨礦含量、骨密度明顯降低,血清骨鈣素含量均顯著下降(P<0.01,表2)。
表1 性早熟患兒治療前后子宮、卵巢體積、血清E2含量的變化(±s)
表1 性早熟患兒治療前后子宮、卵巢體積、血清E2含量的變化(±s)
注: *與治療前相比,P<0.01
分組 例數(shù) 子宮體積(ml)卵巢體積(ml)血清E2含量(pmol/L)治療前 73 4.0±0.5 1.6±0.3 174.84±16.40治療后 73 2.6±0.4* 1.4±0.3 85.91±9.65*
表2 性早熟患兒治療前后骨骼發(fā)育指標的變化(±s)
表2 性早熟患兒治療前后骨骼發(fā)育指標的變化(±s)
注:*與治療前相比,P<0.01
分組 例數(shù) 骨礦含量(g/cm)骨密度(g/cm2)血清骨鈣素(μg/L)治療前 73 0.552±0.080 0.537±0.067 16.85±3.16治療后 73 0.399±0.093* 0.417±0.056* 10.06±3.37*
2.2.1 中藥治療對染毒動物子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響
可見實驗組與溶劑對照組相比,子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度均顯著增高,說明4-NP及BPA對生殖器官及骨骼均有顯著的擬雌激素作用;而治療組與實驗組相比子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度均顯著下降,說明所用中藥對4-NP及BPA的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用(表3)。
表3 中藥對EEDs作用下幼雌SD大鼠子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響(±s)
表3 中藥對EEDs作用下幼雌SD大鼠子宮濕重、臟器系數(shù)及骨密度的影響(±s)
注:#與溶劑對照組比較,P<0.05,*與實驗組比較,P<0.05
分組 例數(shù) 子宮濕重(mg) 臟器系數(shù)(‰) 骨密度(g/cm2)4-NP 實驗組 8 0.081±0.009# 0.74±0.13# 0.0822±0.019#4-NP 治療組 8 0.055±0.008* 0.48±0.12* 0.0553±0.0117*BPA實驗組 8 0.067±0.007# 0.61±0.13# 0.0940±0.0172#BPA治療組 8 0.051±0.005* 0.40±0.05* 0.0596±0.008*溶劑對照組 8 0.042±0.007 0.36±0.02 0.0651±0.0101
2.2.2 中藥治療對染毒動物子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達的影響
可見實驗組與溶劑對照組相比,子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表達水平均顯著增高,說明4-NP及BPA對生殖器官具有顯著的擬雌激素作用;而治療組與實驗組相比,子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA的蛋白表達水平均顯著下降,說明所用中藥對4-NP及BPA的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用(表4)。
EEDs可通過與靶器官上的雌激素受體(ER)結(jié)合發(fā)揮擬雌激素作用。ER具有多個配體結(jié)合部位,除能與天然雌激素結(jié)合外,還可與多種EEDs結(jié)合。EEDs與ER結(jié)合后可激活ER啟動基因轉(zhuǎn)錄促進蛋白合成,也可以與天然雌激素發(fā)揮協(xié)同作用,激發(fā)雌激素效應(yīng)的產(chǎn)生[2]。
本研究臨床部分的結(jié)果顯示,對篩查出的EEDs血清含量較高的性早熟患兒,給予中藥合劑口服治療3個月后,患兒的子宮體積明顯回縮,血清E2含量顯著下降,骨礦含量、骨密度及血清OST含量也顯著下降,說明中藥合劑對EEDs在患兒生殖器官及骨骼上的擬雌激素效應(yīng)具有顯著的拮抗作用。
表4 中藥對EEDs作用的幼雌SD大鼠子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達的變化(±s)
表4 中藥對EEDs作用的幼雌SD大鼠子宮內(nèi)膜上皮高度、平滑肌厚度及PCNA蛋白表達的變化(±s)
注:#與溶劑對照組比較,P<0.05;*與實驗組比較,P<0.05
分組 n 內(nèi)膜上皮高度(μm) 平滑肌厚度(μm) 陽性細胞面積(μm2)4-NP實驗組 8 23.27±5.64# 82.29±13.92# 5 490.25±678.58#4-NP治療組 8 17.45±4.30* 55.20±10.20* 4 301.59±464.02*BPA 實驗組 8 20.85±2.94# 68.27±7.42# 5 062.76±182.34#BPA治療組 8 16.63±3.42* 48.77±5.03* 4 114.62±223.80*溶劑對照組 8 9.75±2.59 33.66±5.60 3 350.55±394.15
本研究動物實驗部分的結(jié)果顯示EEDs可使染毒動物子宮增重、子宮內(nèi)膜及平滑肌增生、子宮內(nèi)膜PCNA的蛋白表達上調(diào)、骨密度增高,說明EEDs對生殖器官及骨骼均具有顯著的擬雌激素作用;同時喂飼中藥合劑可使染毒動物生殖器官及骨骼的病變顯著減輕,進一步印證了臨床觀察的結(jié)果,證實所用的中藥合劑對EEDs的擬雌激素活性具有顯著的拮抗作用。
[1] 蔡德培. 性早熟及青春期延遲[M]. 上海: 上??茖W(xué)技術(shù)文獻出版社, 2005: 163-171.
[2] Simons SS Jr. Environmental estrogens: Can two “Alrights ”make a wrong?[J]. Science, 1996, 272(5267): 1451.