儲糧微生物危害檢測技術(shù)研究進展

張燕燕 蔡靜平 蔣 澎

ZHANG Yan－yanCAI Jing－pingJIANG Peng

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

糧食儲藏過程中的品質(zhì)易受到氣候、季節(jié)等自然因素和糧食品種、入庫水分等自身因素的影響。若要提高糧食的儲藏效果，保持糧食的食用品質(zhì)，需要對糧食儲藏過程中的各種變化進行實時監(jiān)測，保證儲糧安全。糧食中除了淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等基本營養(yǎng)物質(zhì)組成外，還含有各種維生素、微量元素等多種天然有機物質(zhì)，是各種微生物生命活動中較為理想的天然營養(yǎng)基質(zhì)，在合適的溫度和濕度條件下，它們的生長、繁殖會引起糧食的品質(zhì)劣變。尤其是微生物中的霉菌，其生長繁殖能力強，可直接或間接的利用糧食中的各種營養(yǎng)物質(zhì)，分泌多種水解酶（淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶）將糧食轉(zhuǎn)化為自身所需的小分子營養(yǎng)成分，進行代謝活動，使糧食的各種品質(zhì)指標(biāo)和加工工藝指標(biāo)發(fā)生變化，嚴(yán)重影響糧食的價值，有些霉菌，例如黃曲霉菌（Aspergillusflavus）會產(chǎn)生劇毒的黃曲霉毒素進一步危害人畜健康［1］。因此，對儲糧過程中霉菌活動的監(jiān)測是保障儲糧安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)的霉菌培養(yǎng)檢測方法雖然可以為儲糧的安全性提供一定的指示，但是其檢測操作技術(shù)專業(yè)性強、要求高、操作程序繁瑣、檢測工作量大、時間長，難以滿足儲糧經(jīng)常性監(jiān)測的需要。另外，糧食中的許多霉菌生長速率和營養(yǎng)要求的差異性大，使一些本來在儲糧環(huán)境中不能進行生長和代謝活動的霉菌孢子萌發(fā)和迅速生長，給帶菌量的檢測結(jié)果帶來干擾。例如，常見的根霉 （Rhizopus）和毛霉（Mucor）等霉菌在大多數(shù)糧食儲藏條件下是不能生長的，但在人為培養(yǎng)的適宜水分和溫度條件下卻會以遠(yuǎn)超曲霉的速度生長。實際儲糧中初期的危害霉菌通常為灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）和青霉（Penicillium），隨著水分的增高，黃曲霉和其他曲霉逐漸變?yōu)閮?yōu)勢曲霉［2］。但是在平板菌落培養(yǎng)技術(shù)中檢測到這種變化不明顯，使檢測結(jié)果不能準(zhǔn)確反映儲糧環(huán)境中正常生長霉菌的類群，影響人們對糧情的判斷。此外，霉菌的生長周期需要7d左右，檢測結(jié)果不能與實際糧情變化同步，表現(xiàn)出滯后性［3］。

近年來，在食品行業(yè)應(yīng)用較多的分子生物學(xué)微生物檢測技術(shù)也被用來檢測儲糧霉菌，如DNA探針技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等［4］，這些技術(shù)雖具有較高的靈敏度和檢測準(zhǔn)確性，但操作程序復(fù)雜，對操作人員技術(shù)程度要求高、檢測費用昂貴，在儲糧監(jiān)測中的應(yīng)用受到限制。利用霉菌生物學(xué)特性對儲糧安全的監(jiān)測已經(jīng)有較多的研究和應(yīng)用，可以滿足不同糧食和儲藏特點的需求。文章主要闡述利用微生物生物學(xué)特性監(jiān)測儲糧安全的研究進展。

1 糧溫檢測技術(shù)

糧食儲藏過程中出現(xiàn)霉菌生長時，由霉菌呼吸釋放出的熱量將大大超過糧食自身呼吸所釋放的熱量，由于糧堆是熱的不良導(dǎo)體，造成熱量在糧堆中積累，使糧堆溫度升高，借助糧堆溫度檢測的方法可以快捷地發(fā)現(xiàn)儲糧的異常狀態(tài)［5］，這是糧溫檢測技術(shù)在儲糧中應(yīng)用的基礎(chǔ)。從1998年起，中國對大型儲備糧庫開始進行重點建設(shè)，糧倉倉容、結(jié)構(gòu)、設(shè)施以及管理手段都上了一個新臺階，糧溫檢測技術(shù)被進一步推廣和普及，成為儲備糧庫中標(biāo)配的儲糧工藝之一［6］。

糧溫檢測技術(shù)由最初的溫度計檢測發(fā)展到電子傳感器檢測，并隨著電子傳感、計算機和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的不斷創(chuàng)新而快速發(fā)展。早期的測溫傳感器通過測量糧堆內(nèi)部生命體代謝所釋放出的熱量，經(jīng)過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)最終將數(shù)字顯示在測溫表上。隨著電子技術(shù)的發(fā)展，由傳統(tǒng)的熱敏電阻、PN結(jié)溫度、熱電偶傳感器向集成化溫度傳感器方向發(fā)展［7］。集成化溫度傳感器是將熱敏原件、信號處理和校正等各種輔助電路集成在一起的半導(dǎo)體集成電路型溫度傳感器［8］，具有檢測靈敏度高、線性好、不需要任何溫度參考點等優(yōu)點，不僅簡化了傳統(tǒng)的電路設(shè)計工序，還提高了測量精度，從而被迅速地普及和推廣。

在實倉儲藏中，考慮到成本等因素，中國大型糧倉主要使用的是數(shù)字化溫度傳感器［9］，可以實現(xiàn)自動巡回檢測，并開發(fā)出了無線檢測系統(tǒng)，簡化了復(fù)雜的布線工序，將無線測溫傳感器插入到糧堆的不同位置，可對糧堆中不同橫向距離和深度進行立體檢測，通過計算機平臺的控制可以準(zhǔn)確定位到糧堆的不同位置采集數(shù)據(jù)，實現(xiàn)全方位、立體化監(jiān)控，若有異常，可立即采取措施。雖然糧溫檢測是目前中國大型糧倉采用的主要糧情監(jiān)測方法，但是隨著對儲糧安全要求的提高，該方法有些缺陷也逐漸顯現(xiàn)出來。首先，糧溫檢測仍具有滯后性，大量實倉儲藏研究［10］表明，測溫系統(tǒng)顯示溫度異常時，糧食往往已經(jīng)發(fā)生霉變、變色、變味甚至出現(xiàn)結(jié)塊。其次，在糧食早期霉變過程中，霉菌釋放的熱量較少且糧堆表面所產(chǎn)生的熱量容易散失，會給測量結(jié)果造成干擾，不易做到糧食霉變早期的監(jiān)測。所以，除了繼續(xù)研究和開發(fā)測溫傳感器以提高糧溫檢測靈敏度和準(zhǔn)確度外，還應(yīng)該利用儲糧霉菌代謝活動的其他特性研發(fā)儲糧安全監(jiān)測的方法。

2 CO2氣體檢測技術(shù)

糧食呼吸和霉菌呼吸均能產(chǎn)生CO2氣體，如果溫度和水分達(dá)到適合霉菌生長的情況，那么霉菌的呼吸強度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于糧食自身的呼吸強度，霉菌呼吸作用釋放CO2氣體的量也遠(yuǎn)大于糧食自身呼吸釋放CO2氣體的量［11］。依據(jù)霉菌呼吸產(chǎn)生CO2氣體這一生理特性，已研發(fā)出多種CO2氣體傳感器。一般的檢測原理是利用微型真空泵采集糧堆氣體，通過流量計的控制將氣體輸送到CO2氣體傳感器進行測量，數(shù)值最終在顯示屏幕中讀取，依據(jù)CO2氣體含量的變化監(jiān)測儲糧霉菌的活動狀態(tài)，以及時采取措施保證糧食安全。CO2氣體檢測技術(shù)用于監(jiān)測儲糧安全的實驗室研究已經(jīng)較為深入。梁微等［12］進行了不同水分含量小麥模擬儲藏中CO2氣體含量變化與小麥帶菌量相關(guān)性的研究，證明隨著小麥水分含量的增加，檢測的CO2氣體含量隨著小麥儲藏天數(shù)的增加逐漸上升，超過安全水分的小麥檢測到的CO2氣體濃度與帶菌量變化的相關(guān)性系數(shù)達(dá)到0.95以上，說明CO2氣體檢測法可以用來指示儲糧中微生物的活動狀態(tài)。耿旭等［13］研究了不同霉菌活動生理狀態(tài)下CO2氣體濃度的變化規(guī)律，霉菌從孢子萌發(fā)、菌絲生長到子代分生孢子形成的階段CO2氣體濃度隨時間的變化呈“S”型曲線；霉菌在代謝旺盛期即菌絲生長階段由于代謝速度加快，釋放出的CO2含量增多，是霉菌開始大量生長的信號。由此可見，CO2氣體檢測技術(shù)的靈敏度更高，可比帶菌量檢測更早、更精確地反映儲糧微生物危害情況，與糧溫檢測相比，CO2氣體檢測可以提高糧食早期霉變監(jiān)測的準(zhǔn)確率。

對實倉糧食儲藏安全的CO2氣體監(jiān)測技術(shù)目前尚處于試驗階段，程樹峰等［14，15］利用便攜式CO2氣體檢測儀對實倉儲藏小麥、稻谷的表面進行霉菌生長的檢測，結(jié)果表明，實倉中安全水分以下的小麥或稻谷檢測到的CO2氣體濃度未見明顯異常，而臨界水分或偏高水分條件下可以明顯檢測到CO2氣體濃度的升高，糧食開始霉變，實倉中易受潮濕的部位CO2氣體的濃度明顯上升。Maier等［11］利用CO2氣體傳感器對實倉中的糧食進行數(shù)年的安全檢測研究，分別在糧倉頂端、倉壁、通風(fēng)口等處設(shè)置CO2氣體傳感器，通過對CO2氣體濃度的檢測證明了實倉中CO2氣體檢測法要比電子測溫法更靈敏、更準(zhǔn)確的判定糧食霉變的程度和位置，根據(jù)CO2氣體傳感器的讀數(shù)總結(jié)出糧食發(fā)霉程度的規(guī)律，CO2氣體體積分?jǐn)?shù)占環(huán)境氣體的0.04%～0.05%以內(nèi)均可視為安全儲藏。王智等［16］通過對模擬糧倉預(yù)設(shè)霉變點探索了稻谷儲藏期間CO2氣體擴散規(guī)律的研究，CO2氣體向水平方向擴散具有沉降性，在糧堆中下層設(shè)置氣體檢測點檢測CO2氣體濃度更能準(zhǔn)確反應(yīng)出實時糧情，通過對CO2氣體擴散規(guī)律的研究進一步提高了儲糧霉菌早期活動的檢測效率。

在實倉儲糧中應(yīng)用CO2氣體檢測技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、成本低等檢測特點，但是，由于糧食儲藏的倉型不同，糧食自身品質(zhì)差異較大，儲藏過程中還有昆蟲等產(chǎn)生CO2氣體生物的影響，加上不同環(huán)境溫濕度將影響CO2氣體的擴散特性，因此，不能只依靠CO2氣體檢測數(shù)據(jù)的變化簡單定義糧食的發(fā)霉情況，需結(jié)合其他快速檢測手段進行綜合判斷。在敞口儲藏的糧堆CO2氣體檢測中，還需考慮CO2氣體釋放對檢測結(jié)果的影響。

3 電子鼻檢測技術(shù)

電子鼻檢測技術(shù)于1982年由Warwick大學(xué)的Persand和Dodd提出［17］，是一類通過模仿哺乳動物嗅覺來對環(huán)境中氣味進行鑒別的裝置，現(xiàn)主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品衛(wèi)生行業(yè)，并向食品生產(chǎn)的在線監(jiān)測研究方向發(fā)展［18］。其在糧食領(lǐng)域中的應(yīng)用目前仍處于實驗室的探索階段。在糧食倉儲行業(yè)，電子鼻的研究方向主要針對糧食新陳度的檢驗、儲糧害蟲以及儲糧霉菌的檢測。

如何在糧食開始霉變初期及時預(yù)測是將電子鼻技術(shù)引進糧食儲藏行業(yè)中的主要目的。N.Magan等［19］研究發(fā)現(xiàn)霉菌利用糧食有機物生長繁殖的過程會生成許多中間代謝產(chǎn)物，且隨著儲藏時間的不同，發(fā)霉糧食所散發(fā)的揮發(fā)性物質(zhì)濃度呈明顯升高趨勢。Linton等［20］對儲藏的小麥、玉米、高粱中揮發(fā)物進行氣質(zhì)色譜聯(lián)用的分析表明，揮發(fā)物由醇類、醛類、酮類、酯類等組成，微量時不易被人們察覺，當(dāng)積累到一定量散發(fā)出刺鼻的氣味時，糧食幾乎喪失了儲藏價值，而電子鼻可以利用自身的氣敏傳感器陣列、信號預(yù)處理單元和模式識別系統(tǒng)靈敏地分析氣體成分，可以在產(chǎn)生氣體初期及時預(yù)警，避免上述情況的發(fā)生。N.Magan等［21］通過對常見儲糧霉菌中間代謝揮發(fā)物的測定也印證了上述結(jié)論。

自1997年Jonsson等［22］通過參考電子鼻在白酒、香水、煙草等方面的應(yīng)用提出電子鼻也可以應(yīng)用到谷物安全檢測之后，圍繞儲糧霉菌早期檢測的研究取得了一些研究進展，主要涉及電子鼻裝置的更新及應(yīng)用。在裝置研發(fā)方面，主要提升氣敏傳感器的靈敏度，采用的方法是相對法、差分法、對數(shù)法和歸一法［23］，為了進一步提高準(zhǔn)確性，采用統(tǒng)計模式識別技術(shù)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和進化神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對輸入的信號進行進一步處理［24］。鄒小波等［25］使用8只傳感器陣列組合對響應(yīng)陣列進行徑向基函數(shù)（RBF）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，對霉變糧食的判定率達(dá)到90%以上。潘天虹等［26］利用厚膜金屬氧化錫氣體傳感器陣列結(jié)合RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)對傳感器模式識別處理系統(tǒng)進行優(yōu)化，提高了電子鼻系統(tǒng)判定谷物霉變的準(zhǔn)確率。偉力國等［27］研制的電子鼻能夠快速對小麥霉變進行識別，該電子鼻檢測系統(tǒng)由5只同系列不同型號的氣敏傳感器組成，每個傳感器提取4個特征值，采用RBF神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行模式識別處理，正確識別率達(dá)到93.3%，證明對小麥霉變的檢測是可行的、有效的。進一步的研究還對電子鼻裝置的設(shè)計進行了穩(wěn)定性的優(yōu)化，包括6點平滑法去除傳感器的噪聲［28］、隨機共振法處理試驗數(shù)據(jù)克服傳感器基線漂移以及不同傳感器陣列的組合優(yōu)化等［29］，此外電子鼻儀器的設(shè)計也向便攜式發(fā)展［30］。國外在儲糧霉菌檢測應(yīng)用方面起步較早，Jonsson等［22］曾應(yīng)用研制的電子鼻裝置判別糧食是否發(fā)霉以及霉變程度，Roberto Paolesse［31］應(yīng)用電子鼻對儲藏中不同谷類表面環(huán)境進行氣體成分分析，并通過GC－MC進行可靠性分析，成功地判定了發(fā)生霉變的谷類。N.Magan等［19］對電子鼻的分析表明，根據(jù)某類霉菌特殊的代謝物質(zhì)可以判定糧食受到何種霉菌的污染。在中國，對電子鼻的應(yīng)用性研究已經(jīng)可以在糧食霉變初期做到成功預(yù)警。近年來，主要利用商品化電子鼻結(jié)合自行研制設(shè)備進行檢測條件的優(yōu)化和應(yīng)用性試驗，宋偉等［32］應(yīng)用德國PEN3便攜式電子鼻檢測儲藏中粳稻的氣體環(huán)境，應(yīng)用偏最小二乘（PLS）分析法提升了預(yù)測粳稻中霉菌數(shù)量的可行性。惠國華等［33］自行研制的電子鼻可以追蹤儲糧霉變的過程。周顯青等［34］對電子鼻傳感器陣列進行優(yōu)化，并對40種玉米樣品進行霉菌檢測，應(yīng)用不同算法（Euclid、Malahanobis、Kohonen和DFA）分析后證明，Kohonen和DFA算法對玉米霉變程度的判斷準(zhǔn)確率可大幅提升。以上研究結(jié)果證明，電子鼻檢測技術(shù)是依據(jù)微生物代謝特性快速檢測儲糧安全的方法，可在儲糧早期霉變檢測中發(fā)揮重要作用。

4 微生物酶活性檢測技術(shù)

微生物酶活性檢測是根據(jù)霉菌在進行新陳代謝的同時，會不斷向外界分泌胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、過氧化氫酶等，利用菌體產(chǎn)酶的代謝特性間接檢測糧食帶菌量的方法。郭雷等［35］對儲糧主要危害性霉菌過氧化氫酶特性進行了研究，證明了不同種類儲糧霉菌可以分泌過氧化氫酶，且過氧化氫酶的酶活性與菌體數(shù)量具有顯著的線性相關(guān)性，酶活性越大，菌體數(shù)量越多。筆者［36］曾以對基于霉菌分泌過氧化氫酶的特性與糧食帶菌量變化建立的聯(lián)系為依據(jù)提出了糧食微生物活性的概念，并對建立的微生物活性檢測法進行可靠性研究，使微生物活性檢測在早期預(yù)防糧食霉變中可以獲得較準(zhǔn)確的信息。試驗結(jié)果表明，在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)霉菌菌體數(shù)量不變的條件下，檢測的活性值卻有較大的差異，但與霉菌生長的跡象一致，因此，在霉菌還未出現(xiàn)明顯生長的情況下，可以快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)儲糧的異常狀態(tài)。在后續(xù)研究［37］中，對不同水分、不同種類的糧食進行微生物活性與糧食品質(zhì)相關(guān)性的研究表明，糧食微生物活性值與糧食品質(zhì)變化有顯著的相關(guān)性，進一步證明了該方法用于檢測糧食微生物的準(zhǔn)確性。魏鑫等［38］利用微生物活性檢測技術(shù)對不同品種小麥霉菌活動的差異進行了研究，該方法與傳統(tǒng)的平板菌落計數(shù)法的分析結(jié)果高度一致，并且采用微生物活性檢測技術(shù)比傳統(tǒng)檢測方法更為靈敏、可靠。胡元森等［39］利用霉菌有氧呼吸過程中脫氫酶的特性，建立了適用于糧食中幾種代表性霉菌脫氫酶活性的測定方法，用該方法測定小麥儲藏過程中微生物活性值與霉菌數(shù)量也發(fā)現(xiàn)有較好的相關(guān)性。

微生物酶活性檢測技術(shù)在實倉儲糧安全監(jiān)測中也有一些試驗性的應(yīng)用。田海娟等［40］利用微生物活性檢測技術(shù)對稻谷儲藏期間微生物的活動規(guī)律進行了研究，在高相對濕度環(huán)境下，糧堆表層的微生物活性值變化明顯，且糧層有阻擋濕度擴散的作用，糧堆下層微生物活性值變化不明顯。在超過1 000t的大型儲藏玉米倉中，利用微生物活性檢測技術(shù)監(jiān)測倉內(nèi)高水分玉米在系統(tǒng)升溫及通風(fēng)降水過程中微生物活動的狀況，根據(jù)微生物活性值制定通風(fēng)、加熱等參數(shù)，達(dá)到了早期防霉儲藏的目的［41］。微生物酶活性檢測法與傳統(tǒng)霉菌檢測方法相比，具有耗時少、靈敏度高、檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確的特點，其顯示結(jié)果反應(yīng)糧食表面活菌的數(shù)量，更加貼切糧食防霉儲藏的本質(zhì)。微生物活性檢測技術(shù)可以提高儲糧霉菌早期預(yù)防的效率，最大限度維護糧食品質(zhì)，提高儲糧的安全性。

5 展望

儲糧安全與糧食微生物的存在狀態(tài)密切相關(guān)，休眠或非生長狀態(tài)的微生物對儲糧安全沒有影響，糧食安全的威脅來自于活動著的微生物，其主要危害類群是霉菌。立足于對霉菌生長和代謝特性相關(guān)的生物學(xué)特性進行檢測，借鑒食品微生物的某些成熟的方法［42］，可以滿足對儲糧安全性的有效監(jiān)測?，F(xiàn)有的相關(guān)方法應(yīng)該根據(jù)糧食的儲藏特性和具體需求，進一步對檢測方法進行適應(yīng)性研究，對儀器、設(shè)備及檢測過程進行優(yōu)化；同時也可通過對微生物的多種生物學(xué)特性進行綜合分析，彌補單因素檢測的不足，更加準(zhǔn)確、有效地反映儲糧安全性的真實狀態(tài)，提高儲糧安全早期預(yù)防的效果，為減少儲糧損失提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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