應(yīng)用基因敲除和RNA干擾技術(shù)研究睪丸特異性新基因

廉 靖，王朝亮，王 瑞，李 銳，張?zhí)鞓?biāo)，張衛(wèi)星

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 河南鄭州 450052)

睪丸特異性基因(testis-specific-gene)，是指主要在睪丸組織中表達(dá)，而在機(jī)體其他組織中不表達(dá)或者極低表達(dá)的基因。睪丸特異性基因主要與睪丸功能有關(guān)，此類基因的正常表達(dá)多與睪丸雄激素產(chǎn)生、精子發(fā)生有關(guān)。部分睪丸特異性基因不僅與睪丸功能有關(guān)，還具有其他生物學(xué)特性，在機(jī)體正常發(fā)育過程中起重要作用。利用基因敲除(Gene knockout)技術(shù)和RNA干擾(RNA interference)技術(shù)選擇性敲除或沉默睪丸特異性基因，并建立目的基因缺失或目的基因表達(dá)減弱動物模型是研究此類基因功能的首選方法。

1 基因敲除技術(shù)研究睪丸特異性基因功能

基因敲除是根據(jù)DNA同源重組的原理而設(shè)計的一項技術(shù)，通過DNA分子的同源重組，特異性地在基因組的某個位點引入預(yù)定的突變，進(jìn)而獲得基因型發(fā)生了改變的基因打靶小鼠，以研究目的基因的體內(nèi)功能或相關(guān)疾病的致病機(jī)制［1］。

1.1 精子發(fā)生相關(guān)的睪丸特異性基因 哺乳類動物的精子發(fā)生(spermatogenesis)需經(jīng)過有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成3個階段，最終由二倍體精原細(xì)胞形成單倍體精子，此過程必須經(jīng)歷一系列不同于體細(xì)胞發(fā)育的生物學(xué)事件，包括姐妹染色體遺傳交換、核固縮、染色質(zhì)重建、頂體和鞭毛形成等［2］。這一獨一無二的發(fā)育過程，是大量睪丸特異性基因按時空順序表達(dá)與睪丸組織內(nèi)外環(huán)境共同作用的結(jié)果，例如，CERM［3］、H1t［4］、MTL-5［5］、Cdc2［6］、Dmcl［7］等皆被證明為睪丸特異性基因并在精子發(fā)生過程中起重要作用，這些睪丸特異性基因表達(dá)缺失會導(dǎo)致精子細(xì)胞數(shù)目減少、形態(tài)畸形、活動能力下降、凋亡增多，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育，主要包括以下幾類基因。

1.1.1 影響精子活動能力的睪丸特異性基因:良好的精子活動能力是男性正常生殖的必要條件之一，精子活動能力下降會直接導(dǎo)致男性不育。

近年來，國內(nèi)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了許多影響精子活動能力的睪丸特異性基因。試驗觀察發(fā)現(xiàn)，Catsper3、Catsper4基因敲除雄性小鼠和野生型雄性小鼠的睪丸重量、精子計數(shù)在8～10周齡沒有顯著差異，但是Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠的精子室溫下經(jīng)過HTF培養(yǎng)基2 h孵育后，其活動精子比率和野生型雄性小鼠相比明顯下降。交配試驗證明，Catsper3、Catsper4基因缺失雄性小鼠不能引起野生型雌性小鼠受孕，上述資料表明，在精子獲能過程中精子超激活需要CatSper3、CatSper4的存在［8］。

另一個和精子活動能力相關(guān)的睪丸特異性基因是CD59b，CD59是位于細(xì)胞膜上的與陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)發(fā)病有關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來，英國科學(xué)家在mRNA和蛋白質(zhì)水平證明，CD59b基本上僅在成年雄性小鼠的睪丸組織表達(dá)，CD59b在其他組織中的微量表達(dá)是由血細(xì)胞污染引起的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)CD59b主要在精子的頂體部位表達(dá)，其mRNA在睪丸組織中的表達(dá)和青春期的發(fā)育同步，這些資料表明CD59b很可能與頂體功能有關(guān)，CD59b缺失將會導(dǎo)致精子獲能障礙，資料表明睪丸特異性基因CD59b在調(diào)節(jié)精子活動能力方面具有非常重要的作用，這些發(fā)現(xiàn)和以前CD59b基因敲除小鼠模型所證明的(CD59b－/－)雄性小鼠漸進(jìn)性不育、精子活性減弱相吻合［9］。

1.1.2 影響精子形態(tài)的睪丸特異性基因:精子發(fā)生過程起始于干細(xì)胞的分化，終止于成熟精子的形成，在此過程中，精子形態(tài)異常、精子畸形會導(dǎo)致男性不育。

Yan等采用常規(guī)的基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞成熟因子1(Spem1)基因在小鼠精子細(xì)胞胞質(zhì)去除(Cytoplasm Removal)的基因調(diào)控中起重要作用，實驗研究發(fā)現(xiàn)Spem1基因敲除雄性小鼠不育，精子胞質(zhì)去除異常、精子頭部因精子尾巴的纏繞而彎曲畸形［10］。此外，德國科學(xué)家在研究睪丸特異性基因Tex18時發(fā)現(xiàn)，Tex18基因敲除雄性小鼠生育力低下，進(jìn)一步的實驗觀察發(fā)現(xiàn)Tex18基因敲除雄性小鼠精子頭部畸形，活動能力低下［11］。

1.1.3 影響精子數(shù)目的睪丸特異性基因:精子數(shù)目減少，是雄性不育的原因之一。美國羅徹斯特大學(xué)科學(xué)家在研究睪丸孤兒細(xì)胞核受體4(TR4)基因時發(fā)現(xiàn)TR4在雄性小鼠出生后16～21 d表達(dá)量最高，并且TR4特異性、階段依賴性表達(dá)于粗線期后期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞，該基因缺失會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，精子數(shù)目減少，TR4基因敲除雄性小鼠體重下降、睪丸重量減輕、生育力低下、睪丸組織切片結(jié)果顯示初級精母細(xì)胞變性、部分睪丸精曲小管壞死。與野生型雄性小鼠相比(TR4－/－)雄性小鼠精子發(fā)生延遲，進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，(TR4－/－)雄性小鼠精子發(fā)生延遲由精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂異常引起。此外，對TR4基因敲除雄性小鼠其他基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，睪丸特異性基因Sperm 1和Cyclin A1在(TR4－/－)雄性小鼠體內(nèi)表達(dá)延遲并同時伴有表達(dá)減弱［12］。由此可知，TR4基因是睪丸組織產(chǎn)生正常數(shù)目精子所不可缺少的條件之一，TR4基因很可能與Sperm 1和Cyclin A1相互作用，協(xié)同促進(jìn)正常的精子發(fā)生過程。

綜上所述，在精子發(fā)生過程中有許多睪丸特異性的基因表達(dá)，分析睪丸特異性基因表達(dá)譜，篩選和鑒定精子發(fā)生過程中起重要作用的睪丸特異性基因，研究其特性和功能，對理解精子發(fā)生的內(nèi)在機(jī)理、防治由精子發(fā)生異常引起的男性不育、研制男性避孕藥等具有重要意義。

1.2 雄激素產(chǎn)生相關(guān)的睪丸特異性基因 雄激素對于睪丸發(fā)育、第二性征成熟、性欲的維持以及促進(jìn)精子發(fā)生有重要作用。睪酮是男子體內(nèi)最重要的雄激素，動物體內(nèi)許多睪丸特異性基因缺失都會影響睪丸合成睪酮的功能或者影響睪酮功能的正常發(fā)揮，睪酮濃度過低或者睪酮正常功能發(fā)揮受阻，睪丸生精功能就會顯著減退進(jìn)而導(dǎo)致雄性生殖能力下降。

目前，與睪丸雄激素產(chǎn)生相關(guān)的睪丸特異性基因的研究報道不多，近年來，國內(nèi)外的專家學(xué)者通過建立基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)了許多影響睪丸雄激素合成的基因，如G蛋白偶聯(lián)受體GPRC6A基因、組氨酸脫羧酶(HDC)基因、芳香烴受體(AhR)基因等，并初步研究了它們在睪丸雄激素合成過程中的作用。實驗研究發(fā)現(xiàn)，GPRC6A基因敲除雄性小鼠睪丸體積、精囊腺重量明顯下降，血液睪酮濃度顯著降低［13］。組氨酸脫羧酶(HDC)基因敲除雄性小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的類固醇激素合成能力顯著下降，主要表現(xiàn)為睪丸間質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)睪酮分泌水平和在hCG誘導(dǎo)下的睪酮分泌水平都下降［14］，而芳香烴受體(AhR)基因敲除雄性小鼠則有30%表現(xiàn)為血液睪酮濃度顯著下降［15］。由此可知，上述3個基因在睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和睪丸類固醇激素的合成過程中具有非常重要的作用。

2 RNA干擾技術(shù)研究睪丸特異性基因功能

RNA干擾(RNA interference，RNAi)，又稱為gene knock-down，是發(fā)生于動物、植物機(jī)體中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，此過程主要由雙鏈RNA(dsRNA)同源互補(bǔ)于靶基因的mRNA來完成。作為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的焦點，RNA干擾技術(shù)被廣泛應(yīng)用于勃起功能障礙、前列腺癌和精子發(fā)生等方面的研究［16］。RNA干擾技術(shù)方便、快捷，克服了基因打靶費時、費用高昂等缺點［17］，是除基因敲除技術(shù)外在活體內(nèi)研究睪丸特異性基因功能的又一方法，國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)利用RNA干擾技術(shù)建立了許多睪丸基因表達(dá)減弱動物模型，進(jìn)而揭示目的基因的功能。我國科學(xué)家利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律鐘基因與雄性小鼠的生殖功能有關(guān)，它很可能通過調(diào)節(jié)精子頂體蛋白的活性進(jìn)而影響精子的受精能力［18］。

雖然RNA干擾技術(shù)方便快捷，但是由于RNA干擾技術(shù)不能作用于所有基因和某些特殊類型的細(xì)胞(神經(jīng)元)，而且RNA干擾技術(shù)只是在轉(zhuǎn)錄后水平上降低目的基因的表達(dá)，其基因沉默效果遠(yuǎn)不如基因敲除技術(shù)干凈徹底，有時也會因基因沉默不徹底導(dǎo)致動物模型表型難以分析。因此RNA干擾技術(shù)在研究睪丸特異性基因功能方面的應(yīng)用遠(yuǎn)沒有基因敲除技術(shù)廣泛。

3 結(jié)語

睪丸的主要功能是分泌雄激素睪酮和產(chǎn)生精子。睪酮不僅參與精子形成，且能促進(jìn)生殖器官和第二性征的發(fā)育，并保持男性特有的生理功能;精子的主要功能是與卵子結(jié)合形成受精卵進(jìn)而產(chǎn)生后代。哺乳類動物的精子發(fā)生是一個不同于體細(xì)胞分化的特殊過程，這一特殊的細(xì)胞分化過程受多種因素的調(diào)控，而生精細(xì)胞內(nèi)基因水平的調(diào)節(jié)，在精子發(fā)生過程中起著決定性的作用［19］。

近年來隨著基因克隆、表達(dá)及功能研究技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)了許多與精子發(fā)生相關(guān)的基因，其中主要是睪丸特異性基因在精子發(fā)生中起重要作用。這些睪丸特異性基因具有發(fā)育階段特異性和組織細(xì)胞特異性的表達(dá)特征，并參與精子發(fā)生過程中特異的細(xì)胞活動。然而對于這一過程中許多關(guān)鍵基因及其功能還知之甚少，需要進(jìn)行更加廣泛深入的研究，基因敲除技術(shù)和RNA干擾技術(shù)是目前研究基因功能的主要方法技術(shù)。近年來，越來越多的睪丸特異性基因逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，如 TSF22［20］、BAFL、T490、TSC21、TSC23、TSC43、RGS22［21］、TDRG1［22］、TSEG-2［23］、TSAF76、mtIQ1［24］、mtIQ2等，進(jìn)一步探討其基因表達(dá)模式、研究其功能特性將有助于我們更好的了解它們在男性生殖方面所起的作用，為男性疾病的治療開辟新的道路。

［1］ Verena G，Stefan S，Andrea S，et al.Targeted disruption of Slc2a8 (GLUT8)reduces motility and mitochondrial potential of spermatozoa［J］.Mol Membr Biol，2008，25(3):224-235.

［2］ Wei Y.Male infertility caused by spermiogenic defects:lessons from gene knockouts［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2009，306(1-2):24-32.

［3］ Juvan P，Perse M，Budefeld T，et al.Novel insights into the downstream pathways and targets controlled by transcription factors CREM in the testis［J］.PloS one，2012，7(2):e31798.

［4］ Bukowska D，Kempisty B，Piotrowska H，et al.The structure and role of mammalian sperm RNA:a review［J］.Veterinarni Medicina，2013，58(2):57-64.

［5］ Skutkova H，Babula P，Stiborova M，et al.Structure，polymorphisms and electrochemistry of mammalian metallothioneins-a review［J］.Int.J.Electrochem.Sci，2012，(7):12415-12431.

［6］ Yu B Z，Song Y T，Yu D H，et al.Expression and immunohistochemical localization of Cdc2 and P70S6K in different stages of mouse germ cells［J］.Cell Biochemistry and Function，2006，24(2): 113-117.

［7］ Masson J Y，Davies A A，Hajibagheri N，et al.The meiosis-specific recombinase hDmcl forms ring structures and interacts with hRad51［J］.The EMBO Journal，1999，18(22):6552-6560.

［8］ Jingling J，Nange J，Huili Z，et al.Catsper3 and Catsper4 are essential for sperm hyperactivated motility and male fertility in the mouse［J］.Biology of reproduction，2007，77(1):37-44.

［9］ Sivasankar B，Claire L H，Rossen M D，et al.CD59a is the primary regulator of membrane attack complex assembly in the mouse［J］.The Journal of Immunology，2004，73(6):3684-3692.

［10］Huili Z，Clifford J S，Kazuto M，et al.Lack of Spem1 causes aberrant cytoplasm removal，sperm deformation，and male infertility［J］.Proceedings of The National Academy of Sciences of the USA，2007，104(16):6852-6857.

［11］Jaroszynski L，Dev A，Li M，et al.Asthenoteratozoospermia in mice lacking testis expressed gene 18(Tex18)［J］.Molecular human reproduction，2007，13(3):155-163.

［12］Xiaomin M，Yifen L，Ningchun L，et al.Targeted inactivation of testicular nuclear orphan receptor 4 delays and disrupts late meiotic prophase and subsequent meiotic divisions of spermatogenesis［J］.Molecular and Cellular Biology，2004，24(13):5887-5899.

［13］Min P，Ling C，Minzhao H，et al.GPRC6A null mice exhibit osteopenia，feminization and metabolic syndrome［J］.PLoS ONE，2008，3(12):e3858.

［14］Mondillo C，F(xiàn)alus A，Pignataro O，et al.Prolonged histamine deficiency in histidine decarboxylase gene knockout mice affects leydig cell function［J］.Journal of Andrology，2007，28(1):86-91.

［15］Baba T，Shima Y，Owaki A，et al.Disruption of Aryl Hydrocarbon Receptor(AhR)induces regression of the seminal vesicle in aged male mice［J］.Sexual Development，2008，2(1):1-11.

［16］Wan H，Xiong C L.RNA interference and its application in andrology research［J］.Zhonghua Nan Ke Xue，2008，14(6):545-549.

［17］Williams C J，Schultz R M.Transgenic RNAi:A tool to study testisspecific genes［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2006，247 (1-2):1-3.

［18］Jiang X H，Zhang L，Wang Y H，et al.The influence of circadian clock gene on mouse sperm fertility in RNAi［J］.Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2008，39(6):929-932.

［19］Tang A，Yan Q，Sun L，et al.Developmental expression of ACRV1 in humans and mice［J］.Andrologia，2012，44(1):16-22.

［20］Aifa T，Yaoting G，Zhiming C，et al.Cloning and character Analysis of a novel testis-specific Gene，TSF22，in mice［J］.Journal of Reproduction and contraception，2007，18(1):11-18.

［21］Yanqiu H，Jun X，Ling C，et al.RGS22，a novel testis-specific regulator of G-protein signaling involved in human and mouse spermiogenesis along with GNA12/13 subunits［J］.Biology of Reproduction，2008，79(6):1021-1029.

［22］Yin G M，Yang J F，Jiang X Z，et al.Molecular cloning of a novel human testis-specfic gene TDRG1［J］.Journal of Southern Medical University，2009，29(4):631-634.

［23］Wang Z Y，Tong Q S，Zeng F Q，et al.Cloning and expression of a novel mouse testis gene TSEG-2［J］.Zhonghua Nan Ke Xue，2009，15(2):99-105.

［24］Hu J R，Xu N，Tan F Q，et al.Molecular characterization of a KIF3A-like kinesin gene in the testis of the Chinese fire-bellied newt Cynops orientalis［J］.Molecular biology reports，2012，39(4): 4207-4214.