解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥機(jī)制研究

劉 思，姚宇紅（指導(dǎo)）

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2010級碩士研究生，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州 貴陽 550003）

解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥機(jī)制研究

劉 思1，姚宇紅（指導(dǎo)）2

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院2010級碩士研究生，貴州 貴陽 550002；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴州 貴陽 550003）

目的：探討解毒化瘀方對HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制。方法：通過制備含解毒化瘀藥的兔血清培養(yǎng)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株后，用免疫組化法檢測細(xì)胞的多藥耐藥基因P-gp。結(jié)果：解毒化瘀方含藥血清能下調(diào)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株的P-gp表達(dá)。結(jié)論：解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)HL60/VCR白血病細(xì)胞耐藥株多藥耐藥與其能下調(diào)P-gp的表達(dá)有關(guān)。

解毒化瘀化方；逆轉(zhuǎn)；多藥耐藥；P-gp

目前白血病治療中最棘手的問題是長期化療藥物導(dǎo)致的多藥耐藥現(xiàn)象，我們采用解毒化瘀方逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制有一定效果，總結(jié)如下。

1 材 料

解毒化瘀方水煎劑的制備：將解毒化瘀方（青黛10g、川芎10g、莪術(shù)15g、山慈姑15g、丹參20g、虎杖20g、重樓30g、補(bǔ)骨脂30g）的飲片放于煎煮容器內(nèi)，加1～2L冷水浸泡30min，煮沸后文火煎熬，直至藥物濃度為1g/mL，再將藥液過濾出來，棄去藥渣。

含藥血清的制備：將18只新西蘭大白兔（購于貴陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心）隨機(jī)分為3個不同劑量組，各組分別按低劑量組3g生藥/kg體質(zhì)量、中劑量組6g生藥/kg體質(zhì)量、高劑量組12g生藥/kg體質(zhì)量，灌服中藥液，每日1次，連續(xù)3天。于末次給藥后2h無菌條件下心臟取血，分離血清，組內(nèi)血清混合，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

正常兔血清的制備：灌藥前1天取兔血，分離血清，方法同前。

試劑及儀器：RPMI-1640培養(yǎng)基（sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），MTT試劑盒（凱基生物），P-gp試劑盒（北京博奧森生物）。超凈工作臺（中國蘇州），CO2培養(yǎng)箱（美國NAPCO），通用酶標(biāo)儀（BIO-TEX美國），倒置顯微鏡（日本尼康TS100-F）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

HL60細(xì)胞的培養(yǎng)：HL60細(xì)胞接種于含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，2～3天傳代1次，更換細(xì)胞液。

HL60/VCR細(xì)胞的培養(yǎng)：HL60/VCR細(xì)胞接種于含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，并加10μg/mL的VCR維持，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，2～3天傳代1次，更換細(xì)胞液。

2.2 細(xì)胞的檢測

MTT檢測細(xì)胞毒作用：取1×105對數(shù)生長期白血病HL60和HL60/VCR細(xì)胞株細(xì)胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，每孔180μL，加至96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個平行孔，分3個劑量VCR組，加入不同濃度VCR后，細(xì)胞在培養(yǎng)板中適應(yīng)生長12h，分別加入實驗藥物各20μL，使每孔終體積為200μL；每一板次測定，均設(shè)一列全空白對照組，不加細(xì)胞和藥物，同樣作其它處理，光密度掃描時，以該列光密度值作本底，校正其它測量值。在37℃，5%CO2濃度，飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h，每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，相同條件下培養(yǎng)4h，離心去上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，微量振蕩器振蕩10min，充分溶解藥物，于自動酶標(biāo)儀檢測各標(biāo)本吸光度（OD）值，計算耐藥倍數(shù)。

免疫組化方法檢測P-gp表達(dá)：采用免疫酶標(biāo)組化方法，將細(xì)胞懸液1×109/L加入24孔板中，每孔1mL。其中12孔再加入含藥血清，37℃、5%CO2孵育2h，細(xì)胞涂片，依次加入一抗、二抗、三抗，堅固紅顯色及蘇木素復(fù)染，普通顯微鏡觀察，陽性結(jié)果為玖瑰紅色。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié) 果

MTT細(xì)胞毒作用：在HL60、HL60/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度梯度VCR，培養(yǎng)72h后，VCR對兩種細(xì)胞是產(chǎn)生了不同的抑制作用，根據(jù)自動酶標(biāo)儀檢測HL60細(xì)胞IC50濃度OD值為33.127，HL60/VCR細(xì)胞IC50濃度OD值為149.001，求得HL60/VCR細(xì)胞耐藥倍數(shù)為4.5倍。

解毒化瘀藥對HL60/VCR細(xì)胞P-gp表達(dá)水平的影響：經(jīng)免疫組化染色后，可見未加藥HL60/ VCR細(xì)胞被染成玫瑰紅色，經(jīng)含藥血清處理后的HL60/VCR細(xì)胞，染色降低，與未加藥的HL60/ VCR細(xì)胞比較有顯著差異，中藥血清聯(lián)合干擾素組亦可見染色明顯降低，研究顯示P-gp在HL60/ VCR細(xì)胞中成高表達(dá)，HL60細(xì)胞成低表達(dá)，加用解毒化瘀方含藥血清處理后，高中低劑量組和干擾素組能夠明顯降低P-gp在HL60/VCR細(xì)胞中的表達(dá)，而空白對照組和兔血清組對表達(dá)無影響。

4 討 論

中醫(yī)對白血病多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制的研究也取得了一定的進(jìn)展，田亮等［1］研究發(fā)現(xiàn)藤黃酸能通過下調(diào)Survivin及P-gp蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對治療藥物的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)白血病K562/A02細(xì)胞的耐藥作用。解毒化瘀方對白血病細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制也有一定的逆轉(zhuǎn)作用，中醫(yī)認(rèn)為白血病主要是因為溫?zé)岫拘暗娜肭郑淠退幹饕怯捎诙拘傲魬?，擾亂血絡(luò)，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)，病情頑纏，反復(fù)發(fā)作［2］。解毒化瘀方中青黛清熱解毒、涼血消腫，含有靛玉紅對細(xì)胞內(nèi)的周期依賴性蛋白激酶有抑制作用，致癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［3］。山慈姑清熱解毒、消腫散結(jié)，含秋水仙堿，能抑制細(xì)胞的有絲分裂，對多種癌細(xì)胞有殺滅作用［4］。重樓清熱解毒、消腫止痛，鄢圣英等［5］研究發(fā)現(xiàn)重樓復(fù)方水煎劑能使癌組織壞死，并且與藥物的濃度呈正相關(guān)性。虎杖、莪術(shù)、川芎、丹參活血、行血、散血、涼血。補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽，其內(nèi)含有補(bǔ)骨脂素為鈣離子通道拮抗劑，蔡宇等［6］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂素能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度逆轉(zhuǎn)HL60/HT耐藥細(xì)胞的耐藥。白血病細(xì)胞耐藥株HL60/VCR進(jìn)行含解毒化瘀藥的兔血清培養(yǎng)后，再進(jìn)行涂片染色，其細(xì)胞的著色并不是很好明顯的玫瑰紅色，說明細(xì)胞中P-gp的含量并不高。而沒有加用含藥血清的細(xì)胞組中的細(xì)胞染色比較明顯，呈現(xiàn)很明亮的玫瑰紅色，說明原耐藥細(xì)胞上的P-gp表達(dá)很高。通過兩組的對比發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀藥含藥血清能夠降低細(xì)胞上的P-gp蛋白，證明解毒化瘀方能夠逆細(xì)胞藥株耐藥的機(jī)制是降低細(xì)胞上的P-gp表達(dá)。含解毒化瘀藥血清組又分高中低3個組，在分別進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)著色深淺不同，含高劑量藥物的血清組明顯比含中劑量藥物的血清組的著色淺，而含中劑量藥物的血清組又明顯比含低劑量藥物的血清組的著色淺，說明不同的藥物濃度對P-gp的表達(dá)影響不同，其中濃度高的下調(diào)P-gp的能力要比濃度低的強(qiáng)，即藥物下調(diào)細(xì)胞上的P-gp的強(qiáng)度與藥物濃度呈正相關(guān)性，證實解毒化瘀藥逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥的機(jī)制與其能夠下調(diào)P-gp有關(guān)，并且這種關(guān)系是正相關(guān)性。馬武開等［7］在對白血病HL60/ADR細(xì)胞Mdr1、NF-JB的表達(dá)及解毒化瘀藥的干預(yù)作用的研究中也發(fā)現(xiàn)含解毒化瘀藥濃度越高的血清作用效果越明顯。另外，在藥物的對照組中還有西藥干擾素對照，雖然干擾素對耐藥細(xì)胞也有逆轉(zhuǎn)作用，但用干擾素與含藥血清合用后效果更為明顯，細(xì)胞呈現(xiàn)的顏色更淺，證實了含藥血清對耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用。

［1］田亮，劉娟，陳寶安，等．藤黃酸對白血病K562/A02細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用［J］．中國實驗血液學(xué)雜志，2012，20（2）：252-257．

［2］馬武開．難治性白血病從毒論［J］．中國醫(yī)藥學(xué)報，2004，19（4）：241．

［3］劉雅波，陶文沂．18種青黛7-氮雜靛玉紅對6種腫瘤細(xì)胞增殖的影響［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（5）：899-906．

［4］厲秀云，李振民．疏肝健胃清熱解毒法治療胃癌前病變65例［J］．陜西中醫(yī)雜志，2009，30（1）：7-8．

［5］鄢圣英，余建平，袁珂，等．蚤休復(fù)方水煎劑抗癌作用及對肝腎毒副作用的研究［J］．中藥材，2008，31（12）：1855-1857．

［6］蔡宇，余紹蕾，徐炎，等．補(bǔ)骨脂素對HL60/HT耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)及對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響研究［J］．中國藥學(xué)雜志，2006，41（12）：905-907．

［7］馬武開，李玉瑩，姚血明，等．白血病HL60/ADR細(xì)胞Mdrl、NF-κB的表達(dá)及解毒化瘀藥的干預(yù)作用［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2011，32（5）：592-595．

Objective：To study the reversion of MDR mechanism of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Method：HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains were cultured with rabbit serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula，then the MDR gene P-gp was detected by immunohistochemistry method.Result：The serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula could down-regulate the expression of P-gp of HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Conclusion：The reversion of MDR of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains is related to that it could down-regulate the expression of P-gp.

Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula；reversion；MDR；P-gp

R255.737

B

1004-2814(2013)04-241-02

2013-01-31