甘露聚糖肽生產(chǎn)技術(shù)研究現(xiàn)狀

王正元，惠 明，杜小波，高春媛，張開平

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 前言

甘露聚糖肽曾用名多抗甲素，是一種新型生物免疫增強(qiáng)劑和生物反應(yīng)修飾物，存在于甲型溶血鏈球菌莢膜和其培養(yǎng)液中.它可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫紊亂，顯著增強(qiáng)自身免疫力，現(xiàn)較多用于治療免疫功能低下或免疫障礙性疾病如反復(fù)感冒、反復(fù)呼吸道感染、白細(xì)胞減少和輔助治療各種惡性腫瘤等[1].國內(nèi)有不少研究是關(guān)于甘露聚糖肽藥理作用的探索，有關(guān)其生產(chǎn)的研究正在隨人們對甘露聚糖肽藥理作用的認(rèn)識而加深，但尚未見國外有在甲型溶血鏈球菌培養(yǎng)液中提取莢膜多糖的報道.甘露聚糖肽自批準(zhǔn)上市以來，取得了較好的療效且毒副作用小，在臨床上應(yīng)用越來越廣泛.目前，關(guān)于甘露聚糖肽藥理作用和免疫功能的綜述很多，但其生產(chǎn)過程、發(fā)酵及提取條件優(yōu)化的綜述很少.作者綜述了甘露聚糖肽的生產(chǎn)提取工藝，并結(jié)合微生物多糖提取中先進(jìn)的工藝技術(shù)對現(xiàn)有甘露聚糖肽的發(fā)酵和提取過程進(jìn)行了展望.

甘露聚糖肽為類白色或微黃色無定形粉末，無臭、無味，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且具有一定均一性的混合物，不存在單糖、雙糖等小分子糖類和游離氨基酸，完全由不同鏈長的甘露聚糖肽分子構(gòu)成，分子質(zhì)量約為71 ku[2].甘露聚糖肽中總糖的含量為87.7%～90.3%，主要為甘露糖以及少量的葡萄糖殘基；氨基酸總含量為4.5%～6.2%，主要為天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸，其中糖鏈與肽鏈的連接有N—糖苷鍵連接和O—糖苷鍵連接兩種方式[3].甘露聚糖肽可增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，誘導(dǎo)胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)，升高外周白細(xì)胞數(shù)量、增強(qiáng)骨髓造血功能[4]，從而可減少免疫逃逸，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的抗病毒能力，增強(qiáng)機(jī)體清除異物的能力，在臨床上可聯(lián)合其他藥物治療惡性腹腔積液[5]、復(fù)發(fā)性皰疹[6]、疫苗無應(yīng)答[7]等疾病.此外，甘露聚糖肽進(jìn)入消化道后，被相應(yīng)的酶分解為甘露寡糖和堿性多肽兩部分[8]，其中甘露寡糖具有提升機(jī)體免疫反應(yīng)[9]、吸附腸道病原菌、促進(jìn)有益菌繁殖[10-11]等作用，堿性多肽具有抑菌功能[12].隨著對甘露聚糖肽藥理作用更深入的研究，其更廣泛的臨床應(yīng)用有待進(jìn)一步發(fā)掘.

1 甘露聚糖肽的生產(chǎn)

甘露聚糖肽主要由甲型溶血性鏈球菌通過液體深層發(fā)酵，培養(yǎng)液經(jīng)除菌體和反復(fù)乙醇沉淀等提取純化得到，然而胞外多糖的產(chǎn)量很低.通過篩選優(yōu)良菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件，或?qū)N進(jìn)行改良可以在一定程度上提高胞外多糖的產(chǎn)量.胞外多糖的產(chǎn)量與菌種有密切關(guān)系，不同菌株合成胞外多糖的能力差別很大，而同一株菌發(fā)酵條件不同，多糖的產(chǎn)量也有差別.目前一些菌種的胞外多糖合成相關(guān)的基因已經(jīng)被克隆與鑒定，使通過基因工程技術(shù)提高胞外多糖的產(chǎn)量成為可能.

1.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

一般細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)量在接近穩(wěn)定期時達(dá)到最高，到達(dá)穩(wěn)定期后產(chǎn)量將不再增加[13].獲得高產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵溫度與菌株培養(yǎng)的最適溫度沒有直接聯(lián)系，有些菌株在較低溫度時胞外多糖產(chǎn)量較高[13]，但并不是其生長的最適溫度.一般相對較低的培養(yǎng)溫度需要較長的培養(yǎng)時間，較高的培養(yǎng)溫度需要相對較短的培養(yǎng)時間，Lee 等[14]在發(fā)酵生產(chǎn)香菇水溶性多糖中證實了這一點(diǎn).pH 值也會影響菌株的生長狀況和胞外多糖的產(chǎn)量，不同菌株和同種菌株在不同培養(yǎng)條件下胞外多糖合成的最適pH 值不同.很多研究證明，甲型溶血鏈球菌產(chǎn)胞外多糖的最適pH 值在7.2 左右[15]，乳酸菌則相對較低，Ayala-Hernandez 等[16]研究了乳酸菌在不同pH 值條件下的多糖及生物量，并指出在pH5.5 時產(chǎn)量高，Ricciardi 等[17]報道嗜熱鏈球菌SY在pH6.4 時胞外多糖產(chǎn)量最高.

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳氮源種類、添加量顯著影響胞外多糖的產(chǎn)量和化學(xué)組成，胞外多糖產(chǎn)量可隨葡萄糖、乳糖和麥芽糖的加入量增加而提高，而且不同菌種的最優(yōu)碳源也有明顯的區(qū)別.一些研究結(jié)果也進(jìn)一步驗證了碳源在胞外多糖發(fā)酵中的重要性.例如，夏帆等[15]通過改良甲型溶血性鏈球菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖15%、蛋白胨3%、酵母膏7%、氯化鈉5%，其葡萄糖含量從5%調(diào)至15%，發(fā)酵液中甘露聚糖肽的含量明顯提高.Zhu 等[18]在研究批式發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖時，在培養(yǎng)對數(shù)期后期連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖，考察單一碳源葡萄糖對胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果多糖產(chǎn)量明顯增高.Tallon 等[13]研究多種碳源（半乳糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖）對植物乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明乳糖是最佳碳源.在培養(yǎng)基中加入不同種類的氮源及離子對于胞外多糖合成量也有很大的影響[19].

2 甘露聚糖肽的分離及純化

2.1 甘露聚糖肽的分離

2.1.1 去除菌體

去除發(fā)酵液菌體的方法主要有過濾除菌和離心除菌，兩種方法的選擇主要依據(jù)發(fā)酵液中菌體的特性.在甘露聚糖肽生產(chǎn)工藝中去除菌體主要采用離心法，培養(yǎng)液甲型溶血性鏈球菌經(jīng)80 ℃，恒溫30～50 min 滅菌后，菌體沉降在發(fā)酵液底部，將已經(jīng)滅活的細(xì)菌培養(yǎng)液通過連續(xù)流離心機(jī)或沉降離心機(jī)離心，收集上清液.但離心法去除菌體的效果差，離心除菌的效果依賴于高效高速離心設(shè)備的投入，且高效離心設(shè)備投資費(fèi)用較高，能耗較大.

微濾是一種以多孔細(xì)小薄膜為過濾介質(zhì)，膜兩面的壓力差使得小分子溶質(zhì)和水通過濾膜的微孔，將細(xì)胞及微粒懸浮物截留下來，目前在工業(yè)中主要用于除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮細(xì)胞懸液.Kuiper 等[20]用微濾膜過濾啤酒酵母，其過濾通量是普通硅藻土過濾效率的40 倍.梁濤等[21]采用有機(jī)微濾膜對結(jié)冷膠發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌試驗，考察不同膜材料的過濾性能，以及結(jié)冷膠濃度、溫度、壓力等操作參數(shù)對除菌效果的影響，結(jié)果表明濾膜污染后采用0.75% HCl 和1% NaOH 交替清洗，可使膜通量得到較好的恢復(fù).采用中空纖維膜或陶瓷濾膜制成的分離器在分離多糖中，以其濾膜開放式通道的特性，可以處理復(fù)雜組分的混懸液，且菌體截留率高，步驟簡單，可反復(fù)利用，造價低和便于維護(hù)管理[21-22].

2.1.2 收集總甘露聚糖肽

目前在甘露聚糖肽生產(chǎn)工藝中沉淀總多糖采用水提醇沉法，將去除菌體的培養(yǎng)液進(jìn)行濃縮，然后在濃縮液中加入乙醇，使乙醇含量分別達(dá)到50%、60%、70%不等，即可逐級沉淀出不同分子質(zhì)量的甘露聚糖肽；也可使乙醇含量達(dá)到較高濃度，沉淀出總的甘露聚糖肽分子，將總甘露聚糖肽進(jìn)行蒸餾水溶解，調(diào)整pH、離心，再進(jìn)行乙醇沉淀，可進(jìn)一步純化甘露聚糖肽；如此反復(fù)提取可獲得符合標(biāo)準(zhǔn)含量的甘露聚糖肽.但水提醇沉法收集總甘露聚糖肽得率低，在進(jìn)行乙醇沉淀時要保持較低溫度進(jìn)行，且反復(fù)醇沉次數(shù)不宜過多，以免藥品生物活性成分降低，而且純化過程中乙醇消耗量大，工藝步驟繁瑣.

超濾是一種新型膜分離技術(shù)，是以超濾膜的選擇性篩分性能來分離、提純和濃縮物質(zhì).目前已在中藥藥品生產(chǎn)過程中廣泛應(yīng)用，通過采用不同孔徑的截留膜，從而達(dá)到去除分子質(zhì)量大的無效成分的目的.王斌等[23]采用超濾法提取裂褶菌胞外多糖，并對超濾條件進(jìn)行了優(yōu)化，可制得純度為75.13%的裂褶菌胞外多糖，收率可達(dá)82.06%.Albani 等[24]采用超濾方法改進(jìn)了流感嗜血桿菌莢膜多糖的純化工藝，并實現(xiàn)了多糖分離過程的簡單、經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保，易擴(kuò)大規(guī)模.本實驗室使用不同孔徑的濾膜對甘露聚糖肽水溶液截留，取得了較好的濃縮純化效果.將超濾技術(shù)用于食藥用菌多糖這種生物活性物質(zhì)分離，具有不降低藥品活性、無污染、分離效率高、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[25].

2.2 甘露聚糖肽的純化

2.2.1 去除蛋白質(zhì)

多糖提取液脫蛋白的主要方法有Sevage 法、三氯乙酸法、鹽酸法、陰離子交換樹脂法等.目前甘露聚糖肽生產(chǎn)工藝中去除蛋白質(zhì)采用鹽酸法，因稀酸提取的多糖具有較高的生物活性.在粗甘露聚糖肽沉淀的水溶液中加入鹽酸，調(diào)整溶液的pH 為1.5～1.7，并保持溫度在4 ℃左右，靜置12 h，然后離心去除蛋白質(zhì).雖然酸沉淀可以去除部分蛋白質(zhì)，但處理過程中要保持低溫，以減少多糖肽在酸性條件下的分解.Sevage 等[26]有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)的方法也可導(dǎo)致多糖較高的損失率，且損失率隨抽提次數(shù)的增加而增大.

離子交換層析是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換介質(zhì)中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離純化的方法.目前已廣泛用于各學(xué)科領(lǐng)域，在生物化學(xué)及臨床生化檢驗中主要用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖及核酸等物質(zhì).張燕等[27]用離子交換層析純化的肺炎克雷伯氏菌莢膜多糖具有較高的免疫生物活性.Takano 等[28]在檢測氨基酸組分的過程中用陽離子交換層析作為檢測復(fù)合物的預(yù)處理，取得了較好的效果.離子交換樹脂法能有效地去除蛋白質(zhì)，經(jīng)檢測，離子交換樹脂處理后的多糖洗液中蛋白質(zhì)的脫除率達(dá)90%以上[29]，而多糖損失率卻很低，具有較好的應(yīng)用前景.

2.2.2 內(nèi)毒素（LPS）含量控制

內(nèi)毒素可引起動物和人發(fā)熱、機(jī)體微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等不良癥狀，影響了藥品的臨床療效，在藥品生產(chǎn)中其含量應(yīng)嚴(yán)格控制.目前醫(yī)藥行業(yè)去除內(nèi)毒素的方法有活性炭吸附、Tritonx-114 萃取[30]、超濾[31]、離子交換色譜等選擇性去除內(nèi)毒素的方法和親和層析等非選擇性去除內(nèi)毒素的方法.

在甘露聚糖肽現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝中，由于內(nèi)毒素與甘露聚糖肽在乙醇中是共沉的，無法用乙醇沉淀除去，去除內(nèi)毒素依舊沿用活性炭吸附的方法[32].活性炭以其較大的比表面積，具有很強(qiáng)的吸附能力，但由于其吸附不是選擇性的，因而不可避免地吸附了藥物中的生物活性物質(zhì)，造成藥物有效成分的損失.

溶液中內(nèi)毒素含量較高時，在水相環(huán)境中內(nèi)毒素形成高分子聚合物，分子質(zhì)量大于300 ku，可控制濾膜的截留分子質(zhì)量來去除小分子溶液中的內(nèi)毒素，該方法要求溶液中的小分子物質(zhì)的分子質(zhì)量與內(nèi)毒素分子質(zhì)量差別較大，甘露聚糖肽平均分子質(zhì)量為71 ku，能夠用超濾的方法去除內(nèi)毒素.向溶液中加入Ca2+將有助于加速LPS 聚合物的形成，提升超濾效果[33].由于LPS 帶負(fù)電荷，因此可以選用陰離子交換樹脂從堿性物質(zhì)中去除內(nèi)毒素，且成本低，吸附量大[34].

根據(jù)內(nèi)毒素的特殊結(jié)構(gòu)，選擇適當(dāng)?shù)呐浠鵞35]，并將其固定于親和色譜的基質(zhì)上合成親和介質(zhì)，即可制成高選擇性、高效能的LPS 吸附劑，可去除溶液中殘余的微量LPS，相對于非選擇性去除方法，親和色譜層析具有較高的優(yōu)越性.將組氨酸作為配基固定于中空纖維膜上，可有效清除溶液中的微量LPS[36].多黏菌素B 對LPS 的類脂A 有親和作用，可選擇多黏菌素B 作為配基，固定于介質(zhì)上去除藥物中的內(nèi)毒素[37].這種親和色層析的方法條件溫和，操作方便，對大分子成分注射劑中的LPS 去除，有著明顯的優(yōu)勢，為去除甘露聚糖肽注射液中微量的LPS 指明了一個新的方向.

3 展望

近年來，甘露聚糖肽作為一種新型生物免疫增強(qiáng)劑，臨床需求量不斷擴(kuò)大，為提取分離工藝提出了更高的要求.這就需要從各方面進(jìn)行研究，包括方法創(chuàng)新、育種技術(shù)和發(fā)酵工藝的改進(jìn)等.在發(fā)酵條件優(yōu)化方面選擇合適的碳氮源及發(fā)酵溫度、pH 等都可促進(jìn)胞外多糖的產(chǎn)量，采用基因工程技術(shù)建立胞外多糖的高產(chǎn)表達(dá)體系將是下一步的研究熱點(diǎn).在提取純化方面，微濾、超濾等膜處理技術(shù)和層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用將推進(jìn)胞外多糖的生產(chǎn)進(jìn)行革命性的改變.膜處理技術(shù)可直接從液體中分離、濃縮特定分子質(zhì)量的多糖物質(zhì)，其工藝有操作簡單、收率高，可避免藥品中活性成分的損失，減少有機(jī)溶劑的使用和避免二次污染等優(yōu)點(diǎn).以高效的去除蛋白質(zhì)技術(shù)與超濾技術(shù)結(jié)合[38]是目前創(chuàng)新的亮點(diǎn)，在香菇多糖提取中已得到應(yīng)用，效果較好.將多學(xué)科先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行融合，并應(yīng)用在甘露聚糖肽生產(chǎn)過程中可以更好地解決其提取純化工藝中的問題，進(jìn)一步提高甘露聚糖肽的產(chǎn)量.

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